雄性生殖细胞体外分化研究现状

生殖细胞的体外研究已建立了多种组织和器官培养系统、精曲小管培养系统、Sertoli细胞和生殖细胞共同培养系统等。随着对血 睾屏障和睾丸细胞极性在体外培养中重要性的逐步重视 ,已初步建立了模拟睾丸分隔结构的双室培养系统和藻酸钙三维培养系统。现有培养系统已经成为深入了解和认识精子发生过程的一种强有力工具。目前在体外已经获得某些动物精子发生的整个减数分裂过程 ,但对雄性生殖细胞体外减数分裂的详细调控机制还知之甚少。

人精原干细胞的磁式分选和功能鉴定

目的 :目前对人睾丸内精原干细胞 (SSC)的生物学本质特性尚缺乏深入研究。本研究旨在寻求人SSC的特异性表面标志以及对其进行有效分选和功能鉴定的合理方法。 方法 :应用α6、β1 整合素、Thy 1 (CD90 )和c kit作为人SSC标志 ,利用免疫磁珠分选技术对成人睾丸单细胞悬液进行多参数复合分选 ,并利用流式细胞仪对分选后细胞的光散射特性和DNA倍体特性进行检测 ;将人分选后生殖细胞进行显微注射移植 ,观察人SSC在裸鼠睾丸内克隆形成的数量及其精子发生的可能性 ,对上述分选后人SSC进行功能性评价。 结果 :分选后α+ 6Thy 1 + c kit-和 β+ 1 Thy 1 + c kit-细胞均为大小、形态特征较为均一的细胞亚群 ,分别占分离细胞总数的 2 %～ 3%和 0 .5 %～ 1 %。其光散射特性分析显示均为明显低侧向散射特征。DNA倍体分析显示明显DNA倍体组成改变 ,合成期和四倍体细胞消失 ,仅有单倍体、二倍体和减数分裂期细胞 ,α+ 6Thy 1 + c kit-细胞群中 ,二倍体细胞数提高至该细胞群的5 1 .2 %。功能性评价结果表明 ,分选后α+ 6Thy 1 + c kit-细胞中干细胞浓度富积约 4 0倍 ,β+ 1 Thy 1 + c kit-细胞中干细胞浓度富积约 2 0倍。 结论 :α6,β1 整合素和Thy 1可作为阳性标志用于人SSC的分选。应用上述标志的复合免疫磁珠分?

人精原干细胞特异性标志的初步筛选

目的:寻求可能用于人精原干细胞(SSC)分离和纯化的特异性表面标志。方法:通过免疫组化方法,应用造血干细胞(HSC)表面标志c-kit、Thy-1,人胚胎干细胞(ES)表面标志阶段特异性胚胎抗原SSEA-3、SSEA-4、碱性磷酸酶(ALP),原始生殖细胞(PGC)标志SSEA-1以及小鼠SSC表面标志α6和β1整合素对成人及胎儿睾丸SSC的特异性表达进行筛选和鉴定。结果:在成人睾丸组织中,α6整合素在生精小管生殖细胞表面存在较广泛而显著阳性表达,而β1整合素主要在生精小管基底部细胞存在显著阳性染色,Thy-1在成人睾丸生精小管基底部细胞可见散在阳性染色,少量间质细胞中亦可见阳性染色。上述3种抗原标志在成人生殖细胞表面的表达具有一定的特异性。在胎儿睾丸生精小管中,可见SSEA-1在生殖细胞表面存在显著阳性表达,具有明显特异性。结论:α6、β1整合素和Thy-1可作为阳性标志用于人SSC的分选。SSEA-1可作为识别胎儿SSC的特异性标志。

人精原干细胞的体外培养及其功能鉴定

目的:通过应用多种培养条件下的生殖细胞共培养体系,寻求人精原干细胞(SSC)长期体外生存和扩增的优化途径。方法:应用磁式分选所获得的α6+Thy-1+c-k it-细胞,分别以STO、MEF、Sertoli细胞为饲养层,于DMEM/F12、DMEM或DMEM-SF培养液条件下短期培养,然后选择胎儿Sertoli细胞作为共培养体系,在32℃、5%CO2、DMEM/F12(含10%胎牛血清)培养条件下,分别观察成人和胎儿生殖细胞的长期培养结果。并应用免疫组化技术和SSC移植技术对培养细胞进行初步生物学特性和功能鉴定。结果:在短期培养中,α6+Thy-1+c-k it-细胞在存在饲养层时,可在DMEM和DMEM/F12培养液中稳定生存,1周内存活率可达90%。长期培养条件下,α6+Thy-1+c-k it-细胞逐渐与Sertoli细胞形成紧密的贴附或镶嵌关系,呈单个、成对、短链状或小团簇状;胎儿SSC与成人类似,部分以圆球形散在分布于Sertoli细胞表面,并常可观察到明显的成对或短链状细胞,部分呈有突起的长梭形扁平细胞,与Sertoli细胞相互形成紧密连接;经反复传代3个月,仍可观察到稳定存在的圆球形SSC贴附于Ser-toli细胞表面。由PKH26标记的α6+Thy-1+c-k it-细胞在移植后2个月可迁移至裸鼠生精小管基膜,表现为单个或成对的细胞。生精小管内荧光细胞计数显示α6+Thy-1+c-k it-细胞在体外培养2、4周后仍然保留54.9%和9.2%的SSC。结论:该培养系统的进一步优化将有利于体外产生大量SSC,并有助于进一步深入了解SSC的生物学特性和男性生精功能障碍的治疗。