通用引物SPF1/GP6++与SPF1/GP6+聚合酶链式反应检测多型别人乳头瘤病毒敏感度的比较

目的对比通用引物SPF1/GP6++与SPF1/GP6+PCR两种方法检测人乳头瘤病毒(HPV)的敏感度和感染型别范围。方法以包含HPV16全长DNA序列的质粒为模板,应用HPV L1基因型别特异性引物进行PCR扩增,获得15种型别HPV模拟靶基因序列并克隆入p EASY-T1载体,将梯度稀释的重组质粒掺入50 ng正常人基因组DNA,模拟各型别HPV感染的待测样本,对比SPF1/GP6+和SPF1/GP6++两组通用引物的检测敏感度。进一步在68例人宫颈癌组织DNA样本中进行对比验证。结果与SPF1/GP6+PCR比较,SPF1/GP6++PCR对HPV11,31,34,39,51,52,53,56,58,61和66型别的检测敏感度提高了1到2个数量级,对于HPV16,18,33和35常见感染型别的检测敏感度相似。应用SPF1/GP6++PCR检测宫颈癌组织HPV感染的总阳性率为98.5%(67/68),检测到11例双重感染和2例三重感染;而应用SPF1/GP6+PCR检测的总阳性率为95.6%(65/68),仅检测到7例双重感染。结论在SPF1/GP6+PCR基础上建立了SPF1/GP6++PCR方法,并证实SPF1/GP6++PCR具有更高的检测敏感度和更广的HPV型别检测范围。

肺腺癌中HLA-G的表达及其与患者预后的关系

目的探讨HLA-G在肺腺癌中的表达及其与患者预后的关系。方法使用c Bio Portal数据分析工具,分析HLA-G分子在肺癌中的表达;Kaplan-Meier Plotter数据库分析HLA-G分子在肺腺癌中的表达及与预后的关系;免疫组织化学法检测HLA-G蛋白分子在223例肺腺癌组织中的表达,分析其与临床病理特征的相关性。结果 HLA-G基因的改变主要表现为扩增和错义突变,其中,扩增突变主要在肺腺癌中。HLA-G分子的表达与肺腺癌的预后呈负相关,HLA-G高表达组患者总生存期明显短于低表达患者。结论 HLA-G分子在肺腺癌中高表达,在肺腺癌中是一种不良预后因素。

小动物活体成像系统Spectrum-CT在人肺癌裸鼠原位移植瘤模型建立中的应用

目的应用小动物活体成像系统Spectrum-CT对3种不同方式建立的人肺肿瘤裸鼠原位移植瘤模型进行实时监测和生物学特性比较,为肺癌研究提供更有价值的实验动物模型。方法构建稳定表达荧光素酶的人肺癌A549细胞株(A549-Luc),应用胸腔注射法、尾静脉注射法和气管灌流法将A549-Luc细胞分别接种于裸鼠(每组6只),建立人肺癌原位移植瘤模型。应用Spectrum-CT活体成像系统对3组模型鼠进行生物发光成像,监测肿瘤组织的生长情况和荧光信号强度,每周1次,连续监测4周,最后解剖裸鼠肺组织进行体外发光成像和病理学分析。结果生物发光成像分析结果显示,3种模型鼠移植瘤组织均持续生长,建模第4周,胸腔注射组模型鼠的荧光信号强度值[(2.78±0.18)×106 P/s]强于气管灌流组[(1.45±0.20)×106 P/s]和尾静脉注射组[(1.35±0.14)×106 P/s](F=62.53,P<0.01);3D活体成像分析显示,3组模型鼠肺癌移植瘤组织呈不同的生长状态,胸腔注射法模型鼠呈右侧肺叶接种位点处单点肿瘤灶生长,气管灌流法模型鼠肿瘤灶呈左右两侧肺叶不确定多点生长模式,尾静脉注射法模型鼠肿瘤灶相对较为均匀地分布在左右两侧肺叶上。结论与气管灌流法和尾静脉注射法模型鼠比较,胸腔注射法原位肺肿瘤模型成瘤更快,在开展移植瘤主动定位研究方面存在优势;结合使用Spectrum-CT活体成像系统,在原位肺肿瘤模型建立的早期阶段就可以对移植瘤组织的生长情况进行实时定位和定量分析,可为肺癌发病机制和药学研究提供有价值的实验材料。

二烯丙基三硫化物对人胃癌细胞株BGC823和AGS叶酸受体α表达的影响及相关调控机制

目的探讨二烯丙基三硫化物(DATS)对人胃癌细胞叶酸受体α(FRα)表达的影响及相关调控机制。方法选择人胃癌细胞株BGC823、AGS,用10、20、40、80μmol/L DATS处理BGC823细胞48 h,5、10、20、40μmol/L DATS处理AGS细胞48 h,以6μmol/L组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂曲古抑菌素A(TSA)处理细胞作为表观遗传研究的阳性对照,以未经DATS处理的细胞作为阴性对照。采用流式细胞术检测DATS诱导胃癌细胞凋亡情况。在DATS处理BGC823、AGS细胞48 h后,换无DATS细胞培养液培养不同时间,检测FRα蛋白表达变化。采用6μmol/L TSA或40μmol/L DATS处理BGC823细胞和AGS细胞,蛋白质印迹法检测FRα、HDAC1和HDAC2以及组蛋白H3赖氨酸9位点乙酰化修饰(H3K9ac)和组蛋白H4赖氨酸5位点乙酰化修饰(H4K5ac)蛋白表达水平。应用BGC823细胞接种BALB/c裸鼠,建立移植瘤模型,DATS组裸鼠腹腔注射10 mg/kg DATS 16 d后,提取荷瘤组织蛋白,进行靶蛋白表达的检测;对照组注射等量0.9%NaCl溶液。结果BGC823和AGS细胞经梯度浓度DATS处理后细胞FRα蛋白表达均呈剂量依赖性上调(F=65.68,P<0.01;F=26.65,P<0.01)。撤除DATS后,BGC823和AGS细胞FRα蛋白表达逐渐降低并恢复至初始水平(F=74.57,P<0.01;F=30.92,P<0.01)。随着DATS处理浓度的增加,BGC823、AGS细胞凋亡率均增加(F=32.95,P<0.01;F=38.97,P<0.01)。BGC823、AGS细胞经TSA处理后FRα蛋白表达分别上调约4.5倍(t=-12.62,P<0.01)和3.6倍(t=-10.00,P<0.01)。分别经40、20μmol/L DATS作用后,BGC823和AGS细胞FRα蛋白表达水平上调(均P<0.01),HDAC1、HDAC2的表达受抑制(均P<0.01),H3K9ac和H4K5ac的乙酰化修饰水平升高(均P<0.01)。裸鼠荷瘤实验显示,给药后第16天,DATS组移植瘤体积小于对照组[(214±39)mm3比(577±98)mm3],差异有统计学意义(t=4.86,P<0.01)。与对照组相比,DATS组移植瘤组织FRα蛋白表达上调约2倍(t=-5.29,P<0.01),HDAC1和HDAC2蛋白表达水平均下调(t=9.36,P<0.01;t=9.88,P<0.01)。结论DATS以剂量依赖和可逆性方式上调人胃癌BGC823、AGS细胞FRα蛋白表达,其机制可能与DATS影响肿瘤细胞组蛋白乙酰化修饰有关。