细菌多糖-蛋白结合疫苗研究进展

细菌多糖．蛋白结合疫苗在预防由b型流感嗜血杆菌、脑膜炎球菌和肺炎链球菌引起的侵袭性疾病方面起了非常重要的作用。此文就细菌多糖一蛋白结合疫苗结合方法、载体蛋白应用及免疫干扰现象的研究进展作一综述。

白喉类毒素酶联免疫检测法的建立及初步应用

目的建立测定吸附无细胞百白破联合疫苗中白喉类毒素酶联免疫检测（ELISA）方法,并进行验证及初步应用。方法以高效价兔抗DT多克隆抗体和相应酶标抗体建立双抗体夹心ELISA法,确定线性范围同时验证该方法的重复性和特异性等确定检测限度,并初步应用。结果 DT含量在0-0.0160 Lf/m L范围内反应曲线线性关系良好（r〉0.99）。该方法与破伤风类毒素（Tetanus toxoid,TT）、百日咳毒素（Pertussis toxin,PT）、百日咳丝状血凝素（Filamantous hemagglutinin,FHA）与黏着素（Pertactin,Prn）无明显交叉反应,重复性好、特异性较强,精密度及准确度验证均符合常规质控要求,通过验证确定的准确检测范围为0.000 8-0.016 0 Lf/m L;检测限度为0.000 8 Lf/m L。该方法对DT抗原进行了吸附率的检测,同时检测了10批白喉类毒素原液与《中华人民共和国药典》三部2010年版规定的絮状单位检测方法进行对比,变异系数低于20%。结论建立了白喉类毒素双抗体夹心ELISA检测方法,为吸附无细胞百白破联合疫苗生产过程中白喉类毒素含量的质量控制提供了有效技术手段。

脑膜炎球菌疫苗研究与疾病防控策略初探

此文介绍了脑膜炎球菌的特点、传播途径、流行趋势及危害性，讨论了防控流行性脑脊髓膜炎暴发的相关策略，并对目前国内外脑膜炎球菌疫苗的研究现状进行了阐述和评价。

医学药用过滤器安全使用的分析

目的:为提高在医学研究和药品、生物制品生产过程中的过滤技术。方法:通过对医药过滤器的原理、分类与选择的阐述,对两种过滤器使用性能进行比较分析,对除菌过滤、超滤进行探析。结果:明确了医药过滤器的应用要点;根据工艺要求,合理地设计和选配适宜的、最佳的过滤方案与配置。正确地使用过滤器,有效的控制了杂质、微生物,降低制品的污染水平;采用微过滤或超过滤去除细菌,并较好地解决了热原和澄明度的问题。结论:利用好过滤技术,在制药、生物制品的生产过程中对流体和气体中的杂质与细菌进行有效的控制,按药品生产质量管理规范(GMP)的要求保障药品、制品的质量与使用安全。

检测百日咳抗原的系列酶免疫测定试剂盒的稳定性及其在百日咳疫苗生产中的应用

目的 评估检测百日咳毒素（pertussis toxin,PT）、丝状血凝素（filamentous haemagglutinin,FHA）和黏着素（pertactin,Prn）的3种酶免疫测定试剂盒的稳定性及其在无细胞百日咳疫苗（acellular pertussis vaccine,aPV）生产质量控制中的应用.方法 对3种酶免疫测定试剂盒进行热加速试验（37℃放置3 d）和长期稳定性试验（4℃放置6月）,根据试剂盒的标准曲线相关系数、最高浓度标准品与阴性对照的吸光度值之比（P/N）值、质控品回收率评估试剂盒的稳定性.将3种试剂盒用于aPV生产的发酵、纯化、吸附阶段的PT、FHA、Prn定量检测,以确定3种试剂盒对aPV生产质量控制的可行性.结果 3种酶免疫测定试剂盒的37℃热加速试验和4℃长期稳定性试验的各项质量参数均符合相关要求.采用试剂盒定量各生产阶段的百日咳抗原含量显示：百日咳杆菌的发酵终点在第42～46 h;各3批PT、FHA和Prn组分液的纯化回收率分别为49.24％、56.12％和63.65％,68.75％、55.60％和49.76％、75.73％、60.63％和50.10％.采用单独吸附的铝佐剂抗原吸附率高于采用混合吸附,但单独和混合吸附方式制备的疫苗的效力无差异.结论 检测PT、FHA和Prn的3种酶免疫测定试剂盒具有良好的稳定性,可用于aPV生产的质量控制.

无细胞百日咳疫苗特异性毒性检测方法现状及展望

百日咳毒素是百日咳杆菌重要的保护性抗原，经化学方法脱毒成为百日咳类毒素后制成的无细胞百日咳疫苗（acellular pertussis vaccine，APV）具有残余毒性和毒性逆转的可能性，所以建立特异性毒性检测方法对于保证APV的安全性是十分必要的。此文就国内外APV特异性毒性检测方法的现状做一综述，并结合近几年国外研究的毒性检测新方法进行展望。

A、C、Y、W135群脑膜炎球菌多糖疫苗多糖含量测定方法的建立

目的 建立测定A、C、Y、W135群脑膜炎球菌（meningococcus,Men）多糖疫苗（groups A,C,Y,W135 menignococcal polysaccharide vaccine,MPV4）多糖含量的火箭免疫电泳（rocket immunoelectro-phoresis,RIE）法.方法 分别用A、C、Y、W135群Men菌液,A、C、Y、W135群Men菌液加弗氏佐剂,A、C、Y、W135群Men多糖-牛白蛋白结合物免疫家兔,制备特异性抗血清.将制备的抗血清以一定的比例加入琼脂糖凝胶制成平板,并将纯化的多糖作为定量参考品加入抗原孔进行RIE.以多糖含量和对应的RIE峰高作标准曲线并建立直线回归方程.采用优化的RIE法测定MPV4多糖含量和分子大小.结果 菌液加佐剂制备的抗血清效价较理想.在确定的电泳条件下,建立的RIE法制备的标准曲线呈现良好的线性关系,相关系数值均〉0.98.该法特异性较好,未检出各多糖间的交叉反应.采用该法测定的3批MPV4的多糖含量、分子大小及回收率均与先前的检定结果相符,均符合质控标准.结论 建立的RIE法可作为MPV4多糖抗原含量的测定方法.

A群C群脑膜炎球菌结合疫苗的制备

目的制备A群C群脑膜炎球菌结合疫苗,并对其进行生化检测及免疫原性和抗原性分析。方法经溴化氰(CNBr)分别活化的A群、C群脑膜炎球菌荚膜多糖,在己二酰肼(ADH)的连接作用和碳二亚胺(EDAC)的偶联作用下,与破伤风类毒素(Tetanic toxoid,TT)形成结合物。以不同剂量的GAMP-TT和GCMP-TT的混合物免疫小鼠,检测小鼠血清中GAMP、GCMP和TT的抗体滴度,评价其免疫效果。根据剂量试验结果,制备A群C群脑膜炎球菌结合疫苗并进行抗原性检测,并与市售同类产品进行对比试验。结果制备的3批GAMP-AH和3批GCMP-AH的批间差异较小,GAMP-AH和GCMP-AH的衍生率相差较大,由GCMP-AH制备的GCMP-TT的结合率明显高于GAMP-TT(P<0.01),结合物含量差异无统计学意义(P>0.05)。GAMP-TT和GCMP-TT具有良好的免疫原性和抗原性,多糖蛋白结合物组较多糖组可诱导产生更高水平的GAMP和GCMP抗体,且具有免疫记忆。由以上两者制备的A群C群脑膜炎球菌结合疫苗生化指标、血清抗体效价与市售的同类产品差异无统计学意义(P>0.05)。结论成功研制了具有良好免疫原性和抗原性的A群C群脑膜炎球菌结合疫苗,为其产业化奠定了基础。

检测百日咳毒素活性的中国仓鼠卵巢细胞簇集法的建立和初步应用

目的 建立检测百日咳毒素（pertussis toxin,PT）活性的中国仓鼠卵巢（Chinese hamster ovary,CHO）细胞簇集法,并将建立的方法应用于无细胞百日咳疫苗生产的质量控制.方法 将PT标准品系列稀释后与培养的CHO细胞混合,观察PT引起CHO细胞簇集的敏感度,并研究反应时间、反应溶液的pH值、缓冲液浓度、加样顺序等因素对PT引起CHO细胞簇集的影响.应用建立的方法检测百日咳疫苗生产过程中脱毒前后的PT活性及丝状血凝素和百日咳黏着素组分中残留的PT活性.结果 PT使CHO细胞发生最佳簇集的理想反应时间是24h,最适pH值是7～8,适宜氯化钠缓冲液浓度为0.15 mol/L,最优加样顺序是先加CHO细胞再加PT.建立的CHO细胞簇集法的检测敏感度为10pg/ml PT,且重复性良好.结论 CHO细胞簇集法可用于PT活性检测.

伤寒疫苗的现状及展望

伤寒仍是发展中国家的主要公共卫生问题，控制伤寒的最有效措施是接种疫苗。此文介绍了早期伤寒疫苗和现行伤寒疫苗的的安全性和有效性，讨论了伤寒Vi多糖结合疫苗的研发现状及应用前景。

Y和W135群脑膜炎球菌多糖结合疫苗研制

目的建立Y群和W135群脑膜炎球菌多糖结合疫苗的制备方法。方法将脑膜炎球菌荚膜多糖以溴化氰活化及己二酰肼衍生制备多糖衍生物。对衍生条件进行优化，选取适宜衍生条件生产的衍生物与破伤风类毒素在碳二亚胺作用下结合，制成结合疫苗。将疫苗免疫小鼠，检测小鼠血清中抗Y群和W135群脑膜炎球菌多糖抗体滴度。用双向免疫扩散法对结合物进行抗原性检测。采用t检验对结果进行统计学分析。结果用15g／L多糖在pH8条件下活化时间10min以及溴化氰／多糖质量比为1．5的衍生工艺制备Y群多糖衍生物，用15g／L多糖在pH7的条件下活化时间30min以及溴化氰／多糖质量比为1．0的衍生工艺制备W135群多糖衍生物。所制备的结合物稳定性良好并且具有较好的免疫原性和抗原性。与多糖相比，多糖蛋白结合物可诱导较高水平的抗体应答，并且第2和第3针免疫后的抗体滴度明显高于第1和第2针（Y群：t=9．151、3．374，19〈0．01；W135群：t=17．21、2．44，t9〈0．05）。结论经过筛选优化的衍生工艺适合于多糖结合疫苗的研制，由此成功建立了Y群和W135群脑膜炎球菌多糖结合疫苗的制备方法。

测定脑膜炎球菌疫苗C群多糖的双抗体夹心ELISA法的建立

目的建立测定A、C、Y、W135群脑膜炎球菌多糖疫苗（groupsA，C，Y，W135meningococ—calpolysaccharidevaccine，MPV4）C群多糖含量的双抗体夹心ELISA法。方法制备抗C群多糖多克隆抗体，所得的多克隆抗体经辛酸一硫酸铵沉淀法纯化后，用过碘酸钠法对其标记辣根过氧化物酶。分别将抗C群多糖多克隆抗体作为包被抗体和酶标二抗，建立双抗体夹心ELISA法，优化反应条件，对C群多糖进行特异性定量测定。结果建立的双抗体夹心ELISA法特异性较好，未检出与A、Y、W135群多糖的交叉反应。c群多糖在2．5～20．0rig／ml质量浓度范围的剂量反应曲线线性最佳，相关系数大于0．99。该法的准确度和精密度均较好，试验内和试验间变异系数和多糖回收率分别为0．6％～9．1％和87．5％～100．0％，定量限度为4．0ng／ml。采用该法测定3批MPV4显示，C群多糖含量及多糖分子大小K值和回收率的测定结果均与先前的测定结果一致，均符合暂行质量标准。结论建立的双抗体夹心ELISA法可用于MPV4C群多糖的关键质量指标测定。

检测脑膜炎球菌多糖疫苗Y群多糖含量和分子大小的双抗体夹心ELISA法的建立和初步应用

目的建立测定A、C、Y、W135群脑膜炎球菌多糖疫苗（groupsA，C，Y，W135meningococ—calpolysaccharidevaccine，MPV4）Y群多糖含量的双抗体夹心ELISA法。方法采用杂交瘤技术制备抗Y群多糖单克隆抗体，并通过过碘酸钠法用辣根过氧化物酶标记单克隆抗体。分别以抗Y群多糖不同位点的单克隆抗体作为包被抗体和酶标二抗，通过优化反应条件来建立双抗体夹心ELISA法，同时进行方法学验证。结果建立的双抗体夹心ELISA法特异性良好，未检出与A、C、W135群多糖的交叉反应。Y群多糖在2．5～20．0ng／ml范围的剂量反应曲线呈现最佳线性关系，相关系数〉0．99。该法的试验内和试验间准确度较好，精密度较佳，定量限度为4ng／ml。采用该法测定3批MPV4Y群多糖显示，Y群多糖的含量、多糖分子大小‰值和回收率的结果均与先前的检定结果一致，符合暂行质量标准。结论建立的双抗体夹心ELISA法可用于MPV4Y群多糖的关键质量指标测定。

细菌荚膜多糖纯化技术和检测方法的发展

细菌荚膜多糖具有良好的免疫原性,是诱导有效免疫应答的主要抗原物质,可以用来制备多糖疫苗和多糖-蛋白结合疫苗.此文对细菌荚膜多糖纯化技术和检测方法的发展作一综述.

人用疫苗氢氧化铝佐剂吸附力的质量控制初探

目的 建立氢氧化铝佐剂吸附力的相关质控方法.方法 对3批国产氢氧化铝佐剂与丹麦铝佐剂（Alhydrogel）同时进行粒径、比表面积、零电荷点的测定,并比较两种佐剂对不同浓度牛血清白蛋白（bovine serum albumin,BSA）及百日咳丝状血凝素（filamentous hemagglutinin,FHA）的吸附力.结果 测定显示,3批国产铝佐剂50％体积百分比（DV50）的粒径分布分别为4.49、5.83和6.28 μm;比表面积分别为1 602、1 093和1 014 m^2/kg;零电荷点分别为10.2、10.3和10.2.丹麦铝佐剂DV50的粒径为4.58 μm,比表面积为2 230 m^2/kg,零电荷点为8.5.3批国产和1批丹麦铝佐剂（5 g/L）对2 g/L BSA的吸附率分别为98.69％、99.41％、99.72％和98.04％,均符合欧洲药典的吸附力合格标准.国产和丹麦铝佐剂（1.3 g/L）对50～1 000 mg/L FHA的吸附率均在97％以上.结论 根据对国产氢氧化铝佐剂相关质量指标的研究,初步建立了氢氧化铝佐剂吸附力的质控标准.

脑膜炎球菌W135群多糖含量和分子大小双抗体夹心ELISA检测方法的建立及初步应用

目的建立检测A、C、Y、W135群脑膜炎球菌（Neisseria meningitidis,Nm）多糖疫苗（Groups A,C,Y,W135 menig-nococcal polysaccharide vaccine,MPV4）中W135群多糖含量和分子大小的双抗体夹心ELISA法,并进行初步应用。方法以抗W135群Nm多克隆抗体作为包被抗体,建立双抗体夹心ELISA法,采用棋盘滴定法筛选包被抗体与酶标抗体的最佳工作浓度,对W135群Nm多糖进行特异性定量测定,并验证线性关系的重复性;对建立的ELISA法进行特异性、准确度、精密度及定量限的验证;采用建立的ELISA法检测10批W135群Nm多糖样品和10批无关流脑多糖样品,进行W135群Nm多糖的鉴别试验;采用建立的ELISA法测定MPV4多糖含量、多糖分子大小和回收率。结果经棋盘滴定法确定双抗体夹心ELISA法的最佳包被抗体工作浓度为10μg/ml,最佳酶标抗体工作浓度为1∶15 000稀释,W135群Nm多糖在2.5~20 ng/ml浓度范围内剂量反应曲线线性关系良好,相关系数大于0.99。采用建立的双抗体夹心ELISA法检测W135群Nm多糖为强阳性,检测其余样品的结果均为阴性;试验内及试验间测定16、8、4 ng/ml W135群Nm多糖含量的变异系数在1.1%~9.0%之间,回收率在87.5%~105.0%之间,定量限为4 ng/ml;检测W135群Nm多糖的阳性符合率和无关多糖的阴性符合率均为100%。采用该法测定3批MPV4中W135群多糖含量、分子大小及回收率均符合申报MPV4疫苗暂行规程关于W135群Nm多糖的质量标准。结论建立的双抗体夹心ELISA法可用于MPV4中W135群多糖含量和分子大小的测定。

检测百日咳黏着素的酶联免疫吸附法的建立及初步应用

目的 建立定量检测白喉-破伤风-无细胞百日咳疫苗生产过程中黏着素（pertactin,Prn）的方法.方法 纯化的Prn免疫家兔以制备高效价血清抗Prn抗体.辛酸-硫酸铵沉淀法纯化抗Prn多克隆抗体并进行辣根过氧化物酶标记,建立双抗体夹心ELISA法.结果 建立的方法与丝状血凝素和百日咳毒素无交叉反应,特异性较好.该ELISA法在1.25 ～ 80.00μg/L Prn测量区间有最佳线性,相关系数＞0.99.实验内和实验间检测64.0、32.0、16.0 μg/L Prn,变异系数为2.6％～7.7％,回收率为84.9％～ 95.5％,精密度和准确度均符合常规质控要求,因此该法的定量限度为16.0 μg/L.结论 建立的ELISA法可有效检测百日咳疫苗纯化过程中的Prn含量,为组分百日咳疫苗质量控制奠定了重要基础.

检测百日咳毒素的双抗体夹心ELISA法的建立

目的建立白喉-破伤风-无细胞百日咳疫苗生产中百日咳毒素（pertussistoxin，PT）含量的测定方法。方法免疫家兔制备高效价抗胛血清，纯化抗肼多克隆抗体并进行酶标记，建立双抗体夹心ELISA法并对其进行验证。结果建立的方法在0～20ng／mlPT测量区间呈现最佳线性，相关系数〉0．99，且重复性好。检测百日咳丝状血凝素和黏着素，结果均为阴性，说明该法特异性良好。试验内10次、不同试验问3次测定16．0、8．0、4．0、3．0ng／mlPT，变异系数为2．8％～9．7％，回收率为95．7％～106．O％，精密度和准确度验证均符合常规质量控制要求，定量限度为3．0ng／ml。结论该方法能有效检测百日咳杆菌大罐发酵过程中分泌的门，为门质量控制奠定了重要基础。

检测破伤风类毒素的酶联免疫吸附法的建立及应用

目的建立定量检测白喉-破伤风-无细胞百日咳疫苗生产过程中破伤风类毒素（tetanustoxoid，TT）的方法。方法TT免疫家兔以制备高效价血清抗TT抗体。辛酸一硫酸铵沉淀法纯化抗TT多克隆抗体并进行辣根过氧化物酶标记，建立双抗体夹心ELISA法。结果建立的ELISA法与丝状血凝素、百日咳毒素及白喉类毒素无交叉反应，特异性较好。该ELISA法在0．5～16．0Lf／LTT检测区间有最佳线性，决定系数〉0．99。实验内和实验间检测14．0、12．0、6．0、3．0和1．5Lf／LTT，变异系数为4．7％～9．8％，回收率为92．7％～109．0％，精密度和准确度均符合常规质控要求。该法的定量下限为1．5Lf／LTT。结论建立的ELISA法可有效检测破伤风疫苗纯化过程中的TT含量，为破伤风疫苗质量控制奠定了基础。