周围神经损伤与再生:新型修补材料的应用研究与进展

背景:虽然自体神经移植是当前治疗大段神经缺损的金标准,但因其应用受到诸多限制,因此科学家从未放弃探索新型神经修补材料。目的:回顾近年来周围神经损伤领域产生的新观点、再生过程中的关键细胞及新型神经导管的应用。方法:由第一作者检索2001至2016年Pub Med数据库收录的与组织工程神经支架材料相关的文献,检索词为"peripheral nerve injury,peripheral nerve regeneration,nerve scaffold",按纳入、排除标准最后共纳入文献76篇进行综述。结果与结论:周围神经的修复主要集中在如何让再生的神经长得"快"与长得"准"上,未来除了应继续拓展开发生物相容性更好的材料外,还应优化设计,在分子细胞和组织层面多层次模拟神经再生微环境,模拟建立取向纳米结构、化学组分、生物信号时空分布等多重仿生神经移植物。应明确的是,神经导管不应只是简单的力学支撑,还应具有一定功能,如导电、细胞因子梯度缓释等。仿生也不应只局限于形态学上,还应拓展到如细胞因子的时空变化、细胞生物电刺激等方面上来。

干细胞在软骨再生中的应用

软骨损伤是最常见的膝关节疾病之一。由于软骨无血管、神经、淋巴组织,营养成分主要来自膝关节的滑液,这些组织学的特点使得软骨损伤的自我修复能力极为有限。创伤性的软骨损伤和早期的骨性关节炎（OA）会引起患者关节的疼痛和肿胀,若损伤不予处理则会加速关节的退变,引起更严重的功能障碍。

早期体内力学刺激促进藻酸钙复合自体软骨细胞修复羊关节负重区软骨缺损的实验研究

目的观察膝关节持续被动活动仪(CPM)体内力学刺激对组织工程软骨修复大动物关节负重区软骨缺损效果的影响。方法研究、设计和制造能够适用于体内力学刺激羊膝关节软骨缺损修复的膝关节连续被动活动仪(CPM);将实验动物(山羊膝关节双髁负重区制造直径6 mm软骨缺损)分为三组:空白组:单纯缺损未植入修复组织;藻酸钙+骨膜+细胞组:藻酸钙复合自体软骨细胞凝胶植入软骨缺损区,自体骨膜覆盖缺损区;藻酸钙+骨膜+细胞+CPM组:藻酸钙复合自体软骨细胞凝胶植入软骨缺损区,自体骨膜覆盖缺损区,术后早期接受CPM锻炼。分别于术后3个月、6个月、12个月(12个月组仅包括CPM力学刺激组)取材,通过修复组织的大体、组织学观察及其评分比较3组软骨修复效果。结果藻酸钙复合软骨细胞能够较好地修复羊负重区关节面软骨缺损,将缺损修复的大体观察、组织学等结果进行单因素统计学分析,发现接受体内CPM力学刺激组效果最好,其修复组织中透明软骨比例最多,其次为藻酸钙+骨膜+细胞组。结论膝关节持续被动活动仪(CPM)体内力学刺激能够促进组织工程软骨修复大动物关节负重区软骨缺损的效果。

多孔明胶微球对大鼠脂肪干细胞的生物相容性实验

目的探讨明胶来源多孔微球的生物相容性,为进一步体内实验提供科学依据。方法分离培养大鼠乳鼠脂肪间充质干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)并进行三系分化诱导和鉴定。P2代ADSCs体外种植于多孔明胶微球1 d、3 d和5 d后,MTT法检测微球毒性和微球复合细胞后的增殖活性,激光共聚焦显微镜观察微球复合细胞后细胞形态、增殖活性。结果分离培养的大鼠脂肪间充质干细胞呈长梭形,生长良好且三系分化染色呈阳性结果。浸提液组与正常干细胞培养基组的OD值无显著差异。微球复合细胞组的OD值显著高于单纯细胞培养组。激光共聚焦显微镜结果显示微球复合细胞5 d后细胞大量增殖,形态良好。结论明胶多孔微球能够促进脂肪间充质干细胞增殖且无明显毒性,具有良好的细胞相容性,为进一步体内实验奠定了基础。

猪膀胱细胞外基质对人脐带Wharton胶间充质干细胞生物相容性实验

目的探索化学法制备的猪膀胱细胞外基质(porcine bladder accellular matrix,PBAM)对人脐带Wharton胶间充质干细胞(Wharton's jelly mesenchymal stem cells,WJ-MSCs)的生物相容性,为组织工程膀胱的研究提供新的种子细胞。方法采用化学脱细胞法制备PBAM,行HE、甲苯胺蓝、Hoechst33258荧光染色检测脱细胞效果,扫描电镜观察PBAM形态,无水乙醇法检测其孔隙率。组织块法培养WJ-MSCs,观察形态并及行成骨、成脂诱导。比较不同浓度的PBAM浸提液对WJ-MSCs增殖的影响。实验组将WJ-MSCs复合至PBAM进行培养,对照组以DMEM培养,第3、5、7天收集细胞并计数,对细胞-支架复合物行Hoechst33258及AO染色,扫描电镜观察WJ-MSCs在PBAM上的生长状态。结果化学脱细胞法成功制备的PBAM。HE、甲苯胺蓝和Hoechst33258染色证实PBAM上无细胞残留,扫描电镜(SEM)观察PBAM表面呈多孔结构,孔隙率为93%。组织块法培养WJ-MSCs第6天可见WJ-MSCs呈鱼群样排列,行成脂、成骨诱导后,油红"O"和茜素红染色阳性。不同浓度PBAM浸提液对WJ-MSCs的增殖效果与DMEM培养液无差异。两组增殖高峰均在第5天,实验组细胞增加率高于对照组(P <0.05)。将WJ-MSCs复合至PBAM培养第5天后,Hoechst33258染色见大量WJ-MSCs生长于PBAM表面,AO染色提示为活细胞。电镜扫描可见大量人脐带WJ-MSCs黏附生长。结论 PBAM对WJ-MSCs具有较好的相容性,可为进一步研究组织工程膀胱提供实验基础。

人脐带华通胶细胞外基质源性软骨组织工程支架的制备及相关研究

目的采用人脐带华通胶细胞外基质为材料制备软骨组织工程支架,并对其性能进行相关检测。方法人脐带去除外膜及动、静脉,通过机械粉碎、差速离心去细胞、冷冻干燥、紫外及化学交联等方法将华通胶组织制备成三维多孔的软骨组织工程支架,并通过组织化学和免疫组织化学方法检测其成分保留情况;将人骨髓间充质干细胞复合至支架,光镜及电镜下观察细胞在支架上的生长状况及基质分泌情况,初步了解其生物相容性;将人脐带去细胞华通胶支架植入兔背部皮下,通过组织化学及CD4^+/CD8^+T淋巴细胞免疫荧光染色,了解其炎症情况及免疫原性。结果制备得到的人脐带华通胶细胞外基质源性支架为三维多孔支架,保留了华通胶中糖胺多糖和Ⅱ型胶原等成分,糖胺多糖含量为7.05%,总胶原含量为22.5%;接种于支架上的细胞黏附于支架孔壁上,生长状态良好,并有基质分泌;在体试验未见明显免疫反应。结论人脐带华通胶细胞外基质的成分与软骨细胞外基质类似,有利于细胞黏附和生长,无明显免疫原性,是一种较有前景的软骨组织工程支架材料。

周围神经损伤后瓦勒氏变性及神经导管的研究与进展

背景:如何促进损伤的周围神经再生尤其是大段神经缺损是一个棘手的临床难题,亟待解决。目的:回顾近些年瓦勒氏变性机制及神经导管的发展。方法:检索PubM ed数据库,检索词为"peripheral nerve regeneration;Wallerian degeneration;nerve guidance conduits。根据纳入排除标准,选出有关瓦勒氏变性分子机制及神经修复的文献74篇进行探讨。结果与结论:研究发现大鼠SARM1和同源物果蝇d SARM在促进瓦勒氏变性中起关键作用,推断烟酰胺腺嘌呤单核苷酸/烟酰胺腺嘌呤二核苷酸比例的改变可能对SARM1的激活起一定的作用。对于延迟瓦勒氏变性到底是好是坏,目前还存在争议。周围神经损伤后短时间内抑制瓦勒氏变性并积极促进再生达到周围神经损伤及时修复是未来努力的方向。

脱细胞半月板细胞外基质/脱钙骨基质双相半月板支架的制备及其生物相容性的研究

目的成功制备脱细胞半月板细胞外基质/脱钙骨基质双相半月板支架,并与半月板纤维软骨细胞结合研究其生物相容性。方法联合利用湿法粉碎、差速离心等物理方法和胃蛋白酶等化学方法制备脱细胞半月板细胞外基质,利用改良Urist法制备脱钙骨基质,并利用灌注、冷冻干燥等方法分别制备脱细胞半月板细胞外基质支架、脱钙骨基质支架以及脱细胞半月板细胞外基质/脱钙骨基质双相支架等三种不同的支架,并从组织学、分子生物学、生物力学等方面研究三种支架的异同;原代培养兔半月板纤维软骨细胞,并将P3代的纤维软骨细胞分别种植在以上三种支架上,利用扫描电镜、死/活细胞染色等观察细胞生长情况,并分别在3、7、14 d时检测纤维软骨细胞的增殖情况以及分泌胶原和糖胺多糖的含量。结果物理化学联合法脱细胞可以去除半月板中绝大部分的细胞成分,并且很好地保留正常半月板细胞外基质的胶原以及糖胺多糖成分;脱细胞半月板基质支架、脱钙骨基质支架以及脱细胞半月板细胞外基质/脱钙骨基质双相支架三种支架均具有良好的孔隙率,合适的孔径大小,扫描电镜结果显示纤维软骨细胞可以很好地在支架上生长,死/活细胞染色结果显示三种支架均可以维持良好的细胞活性,但是脱细胞半月板细胞外基质/脱钙骨基质双相支架具有更好的生物力学特性,脱细胞半月板基质支架和脱钙骨基质/脱细胞半月板基质双相支架在促进纤维软骨细胞增殖和维持细胞表型方面要比单纯脱钙骨基质支架更优。结论脱细胞半月板细胞外基质/脱钙骨基质双相支架具有较好的生物力学特性,良好的生物相容性,可以促进纤维软骨细胞增殖,同时也可以维持纤维软骨细胞的表型,是一种可以应用于组织工程半月板再生的支架。

大鼠股神经肌支和隐神经损伤前后差异蛋白分析

目的研究股神经肌支和隐神经纤维损伤7 d后二者蛋白表达的差异。方法成年雌性SD大鼠20只,体质量220~250 g。将大鼠右侧股神经干横断,左侧作为对照组不作处理。7 d后分别对正常股神经肌支及隐神经、损伤股神经肌支及隐神经取材,运用同位素标记相对和绝对定量技术标记(114标记正常的股神经肌支;115标记损伤的股神经肌支;116标记正常的隐神经;117标记损伤的隐神经)并结合二维液相色谱-串联质谱技术进行差异蛋白分析。结果共鉴定出3 358个蛋白。其中损伤的股神经肌支与正常的股神经肌支相比差异蛋白293个,表达升高112个,表达降低181个;损伤的隐神经神经与正常的隐神经相比差异蛋白417个,表达升高184个,表达降低233个。结论成功筛选出大鼠股神经运动神经纤维与感觉神经纤维损伤前后的差异蛋白,可为周围神经再生研究提供基础数据。

细胞外基质与能量代谢在骨性关节炎衰老机制中的作用综述

骨性关节炎发病原因众多,其中至关重要的因素是衰老相关的退变。本文主要针对关节软骨中能量代谢障碍和细胞外基质改变进行综述,这些变化导致了炎症反应,加速分解代谢,并伴随关节组织的退变,最终促进骨性关节炎的进展。

两种新型功能化自组装多肽水凝胶的制备和体外研究

目的研究自组装多肽水凝胶的表征及其生物相容性、促轴突再生的作用。方法本文制备两种分别模拟神经生长因子(NGF)和脑源性神经营养因子(BDNF)的功能化自组装多肽,通过圆二色谱分析、扫描电镜和原子力显微镜观察其表征,并将其用于培养雪旺细胞和PC12细胞。结果扫描电镜结果表明这种纳米纤维水凝胶具有类似细胞外基质的三维网络结构,圆二色谱分析和原子力显微镜结果显示该水凝胶具有典型的β折叠的色谱。体外结果表明雪旺细胞能很好地在多肽水凝胶中生长、铺展,同时PC12细胞能在多肽水凝胶中长出不同长度的轴突。结论自组装多肽水凝胶具有类似细胞外基质的纳米纤维结构,与神经类细胞的生物相容性良好,并且能够促进轴突生长。

创伤性神经瘤模型的构建及评价

背景:创伤性神经瘤是周围神经损伤的常见并发症,国内外通过创伤性神经瘤模型进行周围神经修复、再生的基础研究较少见。目的:建立创伤性神经瘤模型并进行鉴定。方法:实验方案经中国人民解放军总医院动物实验伦理委员会批准。选择15只8周健康SD大鼠,显微镜下暴露坐骨神经,用显微剪剪断股后皮神经以远1cm处的坐骨神经,11-0显微线将神经近端缝合于周围肌肉上,远端神经反折后旷置,3周后使用超声和组织学验证神经瘤是否形成。结果与结论:(1)造模3周后,超声可见近端神经明显梭形膨大,为一低回声实质结节,不伴回声;(2)大体观察可观察到近端神经膨大,质稍硬,纤维结缔组织增生,与周围组织粘连;(3)苏木精-伊红染色可见瘤体内纤维组织增生,神经纤维杂乱生长,免疫荧光染色(S100、NF200)可见瘤体内许旺细胞和神经轴突不规则增生;(4)结果表明:实验成功构建了创伤性神经瘤模型。

大鼠感觉、运动神经瓦勒氏变性前后蛋白分析

目的通过同位素标记相对和绝对定量(isobaric tags for relative and absolute quantitation,iTRAQ)技术联合二维液相色谱-串联质谱(liquid chromatography-tandem mass spectrometry,2D LC-MS/MS)技术研究感觉、运动神经损伤7 d后蛋白表达差异。方法成年雄性Wistar大鼠40只,体质量220~250 g,随机分为对照组和实验组,各20只。实验组大鼠脊髓横断,对照组不作处理。7 d后对两组大鼠脊神经前后根神经取材,运用iTRAQ技术标记(114标记正常运动神经;115标记损伤的运动神经;116标记正常的感觉神经;117标记代表损伤的感觉神经)并结合2D LC-MS/MS技术进行差异蛋白分析,并利用基因本体论和京都基因与基因组百科全书信号通路分析差异蛋白所在信号通路。结果共鉴定出4 312个蛋白:1)其中运动神经损伤后差异蛋白数量为637个,表达升高的有265个,表达降低的有372个;2)感觉神经损伤后差异蛋白数量为626个,表达升高的有258个,表达降低的有368个。结论成功筛选出大鼠运动神经与感觉神经损伤前后的差异蛋白,可为周围神经再生研究提供支持。

软骨干细胞修复软骨损伤及治疗骨关节炎的研究进展

软骨损伤通常导致整个关节的病变,从而诱发骨性关节炎。目前已证实关节软骨中存在一类具有自我增殖性、表面抗原表达特性及多向分化潜能的软骨干细胞,该类细胞可以自发聚集到损伤部位进行修复,有利于快速构建软骨修复的微环境。但软骨干细胞的起源和功能尚需进一步明确。本文就软骨干细胞在软骨损伤修复中的作用及对骨性关节炎的治疗等研究进展进行综述。

藻酸钙复合自体软骨细胞修复羊膝关节负重区软骨缺损的实验研究

[目的]以中国山羊为动物模型,观察藻酸钙复合自体软骨细胞修复膝关节负重区软骨缺损的可行性。[方法]取羊肩关节软骨,分离、培养软骨细胞,蕃红"O"、 Giemsa及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色对其进行鉴定。将自体软骨细胞与藻酸钙凝胶复合,修复山羊股骨髁负重区全层软骨缺损(直径6 mm),实验分为四组:(1)缺损旷置组:缺损内未植入任何组织;(2)骨膜覆盖组:自体骨膜覆盖缺损区;(3)藻酸钙+骨膜组:凝胶植入软骨缺损区,并用自体骨膜覆盖;(4)藻酸钙+细胞+骨膜组:藻酸钙复合自体软骨细胞植入软骨缺损区,自体骨膜覆盖;分别于手术后3、6个月取材,通过大体观察及组织学评分检测修复效果。[结果]软骨细胞复合物蕃红"O"、 Giemsa染色及Ⅱ型胶原免疫组化染色结果均为阳性,将藻酸钙凝胶-软骨细胞复合物用于羊负重区关节面软骨缺损修复,从大体观察和组织学评分进行比较,发现各组均有不同程度的组织修复,藻酸钙+细胞+骨膜组效果最好,与其他组差异有统计学意义(P<0.05)。[结论]藻酸钙凝胶-软骨细胞复合物结合自体骨膜覆盖,可较好修复山羊膝关节负重区软骨缺损。

异种红细胞联合膜式氧合灌注装置对人断肢离体机械灌注效果观察

目的探究使用异种洗涤红细胞灌注液对人断肢进行离体机械灌注保存的实验流程及可能性。方法收集来源于左下肢恶性肿瘤截肢患者断肢,肢体离断后置于4℃保温箱中转运至实验室。对断肢进行预处理,并将腘静脉、腘动脉插管后连接灌注系统,使用4℃肝素等渗NaCl溶液对断肢进行灌洗,直至从静脉端流出澄清的等渗NaCl溶液。膜式氧合灌注系统包括:膜式氧合器、蠕动泵、制氧机、储液装置和监护仪。灌注过程中对灌注液电解质和细胞损伤标记物进行监测,同时进行血常规和断肢末端经皮动脉血氧饱和度(SpO_(2))检查;灌注结束后通过苏木精-伊红(HE)染色法进行组织学评价。结果断肢热缺血和冷缺血时间分别为138和65 min。灌注开始后,断肢颜色恢复红润,远端表浅静脉充盈。灌注开始后前6 h断肢末端SpO_(2)维持在98%~100%,最终因断肢末端SpO_(2)下降,灌注终止,灌注时长7 h。灌注开始时白细胞和血小板均处于较低水平,白细胞在灌注开始后有较明显的下降,在3 h后出现上升,最终与灌注开始时数值接近;灌注开始后前4 h内血小板水平较为平稳,4 h后出现较大幅度的上升;灌注过程中红细胞和血红蛋白均呈波动趋势。灌注开始后前6 h内K+浓度较为稳定,之后有较大幅度上升;Na+浓度在整个灌注期间基本维持在生理状态;乳酸脱氢酶和肌酸激酶均呈上升趋势。HE染色示断肢肌肉细胞在灌注过程中体积逐渐恢复后又持续变小,肌间血管可见血栓形成。结论初步验证利用基于异种红细胞对人断肢进行离体机械灌注的可行性,但其保存效果是否达到或接近生理状态并能维持功能,以及免疫排斥反应的程度仍需进一步论证。