脂肪干细胞复合真皮脱细胞基质修复兔关节软骨缺损的实验研究

目的探讨脂肪间充质干细胞(ADSCs)复合小牛真皮脱细胞基质(ADM)参与修复兔膝关节软骨缺损的可行性。方法取自体新西兰兔的脂肪组织,采用酶消化分离培养ADSCs并传代,倒置相差显微镜观察细胞形态,FACS检测细胞表面特异性表达以鉴定细胞,行成脂和成骨诱导鉴定。小牛真皮通过脱细胞、交联和冻干制备小牛ADM,ADSCs达到一定数量后接种于ADM得到细胞支架复合物。24只新西兰大白兔随机分A、B、C共三组,A组关节软骨缺损处外科缝合细胞支架复合物,B组软骨缺损处外科缝合ADM,C组软骨缺损不做任何处理。分别于术后第12周处死动物,修复处行大体、组织学检测。结果成功分离鉴定新西兰兔的脂肪干细胞。经重塑后真皮脱细胞基质支架材料表面光滑、孔隙均匀。ADSCs与ADM复合后,缺损处类软骨组织填充,修复区表面光滑;Ⅱ型胶原免疫组化显示,复合支架已被吸收,再生的软骨是阳性。结论新型小牛ADM支架材料与ADSCs生物相容性好,ADSCs与ADM复合向软骨诱导后可良好地修复关节软骨缺损,具有替代正常软骨的潜力。

锆等离子体浸没离子注入增强聚醚醚酮材料的细胞相容性

目的使用等离子体浸没离子注入技术(PIII)将锆离子注入到聚醚醚酮(PEEK)材料中,并初步评价该材料与人牙龈成纤维细胞(HGFs)的生物相容性。方法将经过PIII改性的PEEK试件作为改性组,未经改性的试件作为对照组,然后与HGFs在体外共培养,扫描电镜观察试件表面形貌,显微镜下对HGFs的细胞形态进行分析,CCK-8检测细胞增殖率以评价材料的生物相容性。结果PIII注入锆离子可在PEEK材料表面成功构建改性层。在培养4 h后,2组试件表面上均有HGFs铺展,且改性组试件表面细胞铺展更开,细胞形态更长,出现的伪足更多。在培养3 d、5 d、7 d后,改性组表面细胞吸光度值较对照组增高,差异有统计学差异(P<0.05)。结论锆等离子体浸没离子注入可在PEEK材料表面成功改性,材料表面的氧化锆纳米结构能够促进HGFs的黏附、增殖,有利于软组织黏附。

HSP90β对人骨肉瘤MG63细胞干性特征的影响及分子影响机制

目的研究HSP90β对人骨肉瘤MG63细胞干性特征的影响及其相关分子机制。方法将骨肉瘤MG63细胞进行慢病毒转染并分为四组:过表达HSP90β组(HSP90β-pEZ)、过表达对照组(NEG-pEZ)、沉默HSP90β组(HSP90β-shRNA)以及沉默对照组(NEG-shRNA)。用Western Blot法测定HSP90β蛋白以及SOX2、OCT4干性蛋白的表达水平,AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR等AKT/mTOR信号通路相关蛋白的表达水平;用细胞迁移实验(Transwell)法测定HSP90β对骨肉瘤MG63细胞迁移和侵袭功能的影响;用甲基纤维素成球(Self-renewal assay)法测定HSP90β对骨肉瘤MG63细胞自我更新的影响。并进行相关分子机制的研究。结果与NEG-pEZ组相比,HSP90β-pEZ组的HSP90β蛋白及干性相关蛋白表达水平明显升高(P<0.05);HSP90β-pEZ组细胞自我更新、迁移及侵袭活力均增加(P<0.05)。与NEG-shRNA组相比,HSP90β-shRNA组的HSP90β蛋白及干性相关蛋白表达水平显著降低(P<0.05);NEG-shRNA组自我更新、迁移及侵袭活力均减弱(P<0.05)。与NEG-pEZ组相比,HSP90β-pEZ组p-AKT、p-mTOR等AKT/mTOR信号通路相关蛋白的表达水平明显升高(P<0.05);与NEG-shRNA组相比,HSP90β-shRNA组、p-AKT、p-mTOR等AKT/mTOR信号通路相关蛋白的表达水平明显降低(P<0.05)。结论HSP90β基因可能通过激活AKT/mTOR信号通路促进人骨肉瘤MG63细胞的自我更新、迁移及侵袭活力,并促进骨肉瘤细胞相关干性基因的表达。这也是HSP90β对人骨肉瘤MG63细胞干性特征产生影响的分子影响机制。

慢病毒介导的干扰及过表达HSP90β对人骨肉瘤细胞系MG-63侵袭的影响

目的通过慢病毒介导的干扰及过表达探讨HSP90β对人骨肉瘤细胞系MG-63侵袭的影响。方法使用慢病毒构建干扰、过表达HSP90β的质粒,通过琼脂糖电泳、测序法鉴定构建慢病毒质粒转染H1299细胞使用嘌呤霉素对MG-63转染细胞进行筛选,计算转染效率实验分干扰对照组(negative control-shRNA)、HSP90p干扰组(HSP90β-shRNA)、过表达对照组(negative control-pEZ)及HSP90β过表达组(HSP90β-pEZ)。以实时荧光定量PCR、Western-blot法检测mRNA和蛋白表达水平。用Transwell小室法检测MG-63侵袭能力。结果插入片段与目的基因序列一致。嘌呤霉素MG-63细胞株最小致死浓度为3 pg/mL,感染复数(multiplicity of m-fection,MOI)为200,感染效率为80%。HSP90β干扰效率为81.15%,过表达组HSP90βmRNA及蛋白相对表达增加(P<0.01)。干扰组HSP90βmRNA及蛋白的相对表达量下降(P<0.01)。与亲本细胞相比,shRNA-HSP90β组MG-63细胞的侵袭能力下降(P<0.01),而pEZ-HSP90β组MG-63细胞侵袭能力增强(P<0.05)。shRNA-HSP90β组的MMP2、Snail表达减少,E-cadherin表达增加,而PEZ-HSP90β组的MMP2、Snail表达增加,E-cadherin表达减少。结论干扰及过表达HSP90β的人骨肉瘤细胞系MG-63构建成功,并稳定表达;HSP90β可通过抑制E-cadherin表达增加MMP2、Snail表达,增强骨肉瘤细胞MG-63的侵袭性。