60Coγ射线照射对血管内皮细胞生物学作用的影响

目的：观察^60 Coγ射线照射对血管内皮细胞生物学作用的影响。方法用不同剂量^60 Coγ射线照射人脐静脉血管内皮细胞（ HUVEC），通过细胞生长曲线和克隆形成实验观察细胞增殖存活情况；流式细胞术检测照射后细胞周期的变化；中性单细胞凝胶电泳及蛋白印迹法（ Western blot ）观察细胞照射后DNA分子损伤及修复情况。结果^60 Coγ射线照射后， HUVEC细胞生长速度及增殖率降低，降低程度与照射剂量呈正相关；HUVEC细胞周期出现G2／M期阻滞；HUVEC细胞出现明显的DNA双链断裂，γH2AX和DNA－PKcs表达增加。结论^60 Coγ射线照射抑制血管内皮细胞增殖，导致G2／M期阻滞，促进DNA断裂，相关修复蛋白表达增加。

人支气管上皮HBE细胞中p53相关的放射诱导表达长链非编码RNA的鉴定和生物功能预测分析

目的鉴定人支气管上皮HBE细胞中p53相关的γ射线诱导表达的长链非编码RNA(lncRNA)分子,为研究与p53关联的lncRNA分子在放射损伤反应如上皮间充质转化中的作用机制提供信息。方法使用CRISPR-Cas9基因编辑技术构建p53敲除的人支气管上皮细胞(HBEp53-/-),Western印迹法检测P53表达水平,lncRNA芯片杂交分析lncRNA表达谱的改变,实时定量RT-PCR分析验证部分lncRNA分子的表达变化,生物信息学技术分析差异变化lncRNA的生物学功能。结果与野生型HBE细胞相比,HBEp53-/-细胞在照射后有239条lncRNA出现上调表达,287条出现下调表达。上调和下调表达前5位lnc RNA的差异表达变化经PCR得到验证。生物信息学GO分析表明,前10位差异表达的lncRNA的靶基因主要涉及β3肾上腺素受体结合蛋白、酪氨酸激酶活性蛋白、DNA结合蛋白、锌离子跨膜转运体蛋白、突触融合蛋白结合蛋白和泛素结合蛋白等分子功能。KEGG分析表明,差异表达lnc RNA的靶基因功能的生物体系统主要涉及感知、神经、免疫、内分泌、环境适应、发育和循环系统等。结论鉴定了人支气管上皮HBE细胞中与p53相关的放射诱导lncRNA分子;经生物信息学预测,发现这些lncRNA分子在细胞照射应答过程中,涉及多种生理功能,参与多个功能信号通路。

VASN核酸适配体与端粒酶逆转录酶脱氧核酶偶联物的生物学功能研究

目的研究肝癌细胞特异性膜蛋白VASN(vasorin)的核酸适配体V4-2与靶向端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)的脱氧核酶(DNAzyme,Dz)偶联形成的偶联物V4-2-Dz在体外和肝癌细胞内的靶RNA切割活性,为脱氧核酶递送提供新策略。方法Mfold网站预测V4-2-Dz的二级结构,通过体外切割实验检测V4-2-Dz的切割活性,通过流式细胞术和激光共聚焦实验检测V4-2-Dz和肝癌细胞HepG2结合的能力,利用RT-qPCR和MTT法分析V4-2-Dz作用于HepG2细胞对h TERT mRNA表达水平和细胞增殖的影响。结果体外切割实验表明,V4-2-Dz具有切割hTERT RNA活性;流式细胞术和激光共聚焦实验结果显示,V4-2-Dz可以特异结合并进入HepG2细胞,V4-2-Dz可显著降低HepG2细胞中hTERT mRNA水平并抑制细胞增殖。结论VASN蛋白的核酸适配体与端粒酶逆转录酶的脱氧核酶偶联物V4-2-Dz具有靶向肝癌细胞递送和切割活性,基于适配体和脱氧核酶的偶联物为肿瘤药物研究提供新的思路。

Polo样激酶1抑制剂Rigosertib对细胞放射损伤的防护作用

DNA双链断裂是电离辐射诱发最严重DNA损伤,能启动细胞周期阻滞、修复和死亡系列信号反应,其中周期阻滞是DNA损伤应答的重要过程,为DNA损伤修复提供了充足的时间。周期蛋白依赖性激酶4/6(cyclin-dependent kinase 4/6,CDK4/6)、周期蛋白依赖性激酶1(cyclin-dependent kinase1,CDK1)和Polo样激酶1(Polo-like kinase 1,PLK1)等是细胞周期调控关键激酶,其抑制剂可以阻滞细胞周期进程,是否具有细胞放射防护作用有待进一步探究。本文选择人宫颈癌细胞HeLa、人正常乳腺细胞MCF-10A以及人脐静脉上皮细胞HUVEC为研究对象,研究比较了PLK1抑制剂Rigosertib、Volasertib,CDK4/6抑制剂Palbocilib,CDK1抑制剂Ro-3306的辐射防护作用。流式细胞术检测表明,Rigosertib、Volasertib、Ro-3306将细胞阻滞于G 2期(P<0.05,P<0.01或P<0.001),Palbocilib将细胞阻滞于G 1期(P<0.05,P<0.01或P<0.001)。免疫荧光检测结果显示,Rigosertib、Volasertib、Ro-330可显著减少γ射线照射后γH2AX foci数目(P<0.001),表明上述药物可促进DNA修复。HR和NHEJ报告系统证实,Rigosertib、Ro-3306同时通过同源重组和非同源末端连接2种修复途径提高DNA修复效率(P<0.05或P<0.001),Palbocilib、Volasertib能提高HR修复效率(P<0.01)。从上述结果优选出PLK1抑制剂Rigosertib进行深入研究,发现Rigosertib可显著降低辐射诱导的细胞凋亡(P<0.05或P<0.01)。CCK-8和克隆形成实验证实,Rigosertib促进受照后细胞的增殖与存活率(P<0.05,P<0.01或P<0.001)。综上所述,我们分析比较了Rigosertib、Volasertib、Palbocilib、Ro-3306四种药物对细胞放射敏感性的影响,其中Rigosertib保护细胞免受辐射损伤最为显著,为放射损伤防护药物的研发提供了新的技术路径和实验依据。

氡暴露小鼠损伤病理及肺组织免疫细胞反应

为探索小鼠氡暴露后不同时间机体损伤及肺组织免疫细胞反应,将BALB/c雌性小鼠饲养于多功能氡室进行连续氡吸入.分别在暴露后15、30、60 d进行呼吸功能评价,采集外周血进行血细胞和血液生化指标检测,取肺组织进行病理形态观察,取T淋巴细胞及其亚群等免疫细胞活化测定.结果显示:氡暴露小鼠出现体质量下降、白细胞减少、电解质代谢紊乱、脂质代谢异常等明显毒性反应,观察到呼吸功能异常及肺组织不同程度病变,且早期肺组织炎性反应明显,主要表现在T淋巴细胞亚群失衡及其活化.这说明氡暴露小鼠存在明显机体不良反应.本研究可为氡吸入的危害评价与医学防护研究提供实验依据.

人IER5基因在昆虫杆状病毒表达系统中的表达与鉴定

目的:利用昆虫杆状病毒表达系统表达早期快速反应基因5(IER5)蛋白,为后续蛋白质结晶及探索蛋白质三级结构提供线索。方法:以HeLa细胞cDNA为模板扩增出IER5基因片段,构建重组转移质粒pFastBac1-IER5;重组转移质粒经双酶切及测序鉴定后转化至感受态细胞DH10Bac,以获得重组的穿梭质粒rBacmid-IER5;将重组穿梭质粒感染Sf9细胞,待细胞出现明显病变时收集重组杆状病毒;用间接免疫荧光、SDS-PAGE及Western blot以及对表达产物进行分析鉴定。结果:重组转移质粒pFastBac1-IER5经双酶切后得到与预期相同的2条条带;重组穿梭质粒rBacmid-IER5经PCR鉴定在3300 bp左右出现一条特异性条带;间接免疫荧光结果提示IER5蛋白在Sf9细胞中得到表达;SDS-PAGE结果显示,表达产物的相对分子质量约为48 k,Western blot结果表明表达产物能与IER5抗体特异性结合。结论:利用昆虫-杆状病毒表达系统成功表达了人IER5蛋白,获得了体外表达重组IER5蛋白的相对分子质量、溶解性等物理化学特性。

δ-生育三烯酚促进小鼠粒细胞集落刺激因子生成作用及其促造血活性

目的探讨δ-生育三烯酚(δ-T3H)诱导小鼠体内粒细胞集落刺激因子(G-CSF)生成的作用,评价δ-T3H促健康小鼠造血活性作用。方法雄性C57BL/6J小鼠分别单次sc给予δ-T3H 12.5,25,50,100和200 mg·kg^-1,于药后24 h采血,酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清中G-CSF水平,分析δ-T3H诱导小鼠体内生成G-CSF的剂量效应。小鼠单次sc给予δ-T3H 100 mg·kg^-1,于给药后3,6,12,24,36,48,72和96 h采血,ELISA检测血清中G-CSF水平和细胞趋化因子1(CXCL1)、粒巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF),白细胞介素6(IL-6),IL-10,IL-12和肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平。雄性小鼠单次sc给予δ-T3H 100 mg·kg^-1,于给药后24 h取材分析组织匀浆中G-CSF水平。雄性小鼠连续sc给予δ-T3H 100 mg·kg^-15 d,于给药后利用ELISA检测血清中G-CSF、红细胞生成素(EPO)、血小板生成素(TPO)和基质细胞衍生因子1β(SDF-1β)的含量,利用血细胞分析仪检测外周血常规参数。δ-T3H按照100 mg·kg^-1分为单次sc给药组和连续2 d sc给药组,于给药24 h后利用流式细胞术分析外周血造血干细胞数量。结果δ-T3H单次给药升高G-CSF的作用呈给药剂量效应,最低有效剂量≤12.5 mg·kg^-1,100 mg·kg^-1给药后升高G-CSF的作用达到饱和;δ-T3H单次给药后48 h内以及连续给药期间小鼠血清G-CSF浓度均可维持在较高水平(36±12)μg·L^-1;细胞因子检测发现,δ-T3H对CXCL1生成有显著促进作用(P<0.05),不影响血清中其他炎症细胞因子(GM-CSF,IL-6,IL-10,IL-12和TNF-α)的生成;δ-T3H显著升高小鼠淋巴-造血组织如胸腺、脾、淋巴结和骨髓组织液中G-CSF水平(P<0.05),对其他组织器官匀浆中G-CSF含量无显著影响;δ-T3H诱导小鼠血清中TPO和EPO略有升高;血常规检测发现,δ-T3H连续给药可显著增加小鼠外周血白细胞数量(主要为中性粒细胞和单核细胞的升高),血小板小幅升高,而淋巴细胞和红细胞则有一过性降低(P<0.05,P<0.01);流式细胞术分析发现,δ-T3H连续2 d sc给药组小鼠外周血造血干细胞数量显著升高(P<0.01)。结论δ-T3H促进小鼠体内G-CSF生成具有专一性以及组织特异性,同时δ-T3H通过刺激体内G-CSF的生成升高小鼠外周血粒细胞数,并促进外周血造血干细胞数量的增加,具有一定的促造血活性。

促癌基因SNORA72对结直肠癌细胞放射敏感性的作用研究

目的探索核仁小RNA(snoRNA)SNORA72基因在不同癌症特别是结直肠癌(CRC)中的表达模式及其对CRC细胞的生长及放射敏感性的影响。方法应用开放的癌症数据库分析SNORA72在不同癌症组织和CRC组织中的表达水平。构建过表达或敲低SNORA72的CRC细胞株HT29,将HT29细胞株分为过表达SNORA72组(LV-SNORA72)及其阴性对照组(LV-NC)、敲低SNORA72表达组(ASO-SNORA72)及其阴性对照组(ASO-NC)。采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测HT29细胞中SNORA72表达情况。分别检测在体外过表达或敲低SNORA72后,对细胞增殖、细胞克隆形成、细胞凋亡、细胞周期的影响。对LV-SNORA72组及LV-NC组的HT29细胞进行不同剂量60Coγ射线照射,检测各组细胞的存活分数(SF)和凋亡率。采用转录组学分析法探讨SNORA72影响HT29细胞生长可能的作用机制。两组间的比较采用独立样本t检验。结果癌症数据库分析发现SNORA72在包括CRC在内的多种癌症组织中高表达,且差异均有统计学意义(均P<0.05)。qRT-PCR检测结果显示,与LV-NC组相比,LV-SNORA72组SNORA72的相对表达水平明显升高[(2.68±0.06)对(1.00±0.17)],且差异有统计学意义(t=16.570,P<0.001)。另外,与ASO-NC组相比,ASO-SNORA72组SNORA72的相对表达水平明显降低[(0.61±0.08)对(1.00±0.13)],且差异有统计学意义(t=4.355,P<0.05)。细胞增殖检测结果显示,在实验的第3、4、5天,LV-SNORA72组的吸光度值明显高于LV-NC组[(0.79±0.05)对(0.51±0.09)、(1.78±0.04)对(1.22±0.05)、(3.30±0.05)对(2.19±0.06)],且差异均有统计学意义(t=8.582、16.400、31.200,均P<0.001)。相反,ASO-SNORA72组的吸光度值明显低于ASO-NC组[(0.42±0.07)对(0.55±0.05)、(1.04±0.08)对(1.25±0.05)、(1.46±0.09)对(1.74±0.08)],且差异均有统计学意义(t=3.957、6.147、8.471,均P<0.01)。细胞克隆形成实验结果显示,LV-SNORA72组的克隆形成率明显高于LV-NC组[(40.87±1.70)%对(26.60±0.40)%],且差异有统计学意义(t=14.140,P<0.001)。相反,ASO-SNORA72组的克隆形成率明显低于ASO-NC组[(9.60±0.40)%对(12.43±0.38)%],且差异有统计学意义(t=8.910,P<0.001)。细胞凋亡检测结果显示,LV-SNORA72组的细胞凋亡率明显低于LV-NC组[(1.89±0.16)%对(2.64±0.15)%],且差异有统计学意义(t=6.115,P<0.01)。相反,ASO-SNORA72组的细胞凋亡率明显高于ASO-NC组[(6.44±0.54)%对(3.92±0.37)%],且差异有统计学意义(t=6.644,P<0.01)。Western blot结果显示,与ASO-NC组相比,ASO-SNORA72组可以促进凋亡蛋白PARP和Caspase3发生剪切活化,Bax蛋白表达水平升高,同时抑制抗凋亡蛋白Survivin和Bcl-2的表达。放射敏感性分析的细胞克隆形成实验结果显示,在经1、2、4、6 Gyγ射线照射后,LV-SNORA72组细胞的SF均较LV-NC组增加[(0.89±0.05)对(0.81±0.03)、(0.64±0.10)对(0.47±0.01)、(0.16±0.04)对(0.09±0.01)、(0.04±0.01)对(0.02±0.01)],且差异均有统计学意义(t=4.063、8.802、4.045、2.937,均P<0.05)。放射诱导的细胞凋亡结果显示,在4 Gy照射后48 h和72 h,与LV-NC组相比,LV-SNORA72组细胞凋亡率明显降低[(8.14±0.12)%对(9.86±0.22)%、(11.26±0.52)%对(15.83±1.54)%],且差异均有统计学意义(t=3.470、9.208,均P<0.05);在8 Gy照射后48 h和72 h,与LV-NC组相比,LV-SNORA72组细胞凋亡率明显降低[(13.29±0.17)%对(14.88±0.58)%、(19.82±0.56)%对(23.7±0.6)%],且差异均有统计学意义(t=3.201、7.819,均P<0.05);在12 Gy照射后48 h和72 h,与LV-NC组相比,LV-SNORA72组细胞凋亡率明显降低[(14.06±0.32)%对(18.56±1.08)%、(22.19±0.02)%对(26.84±0.66)%],且差异均有统计学意义(t=9.054、9.369,均P<0.001)。转录组学分析结果显示,SNORA72过表达影响细胞活化、细胞黏附、免疫和炎症反应,以及细胞迁移和增殖等生物学过程。结论SNORA72在CRC组织中特异性高表达且与患者不良预后相关,过表达SNORA72促进CRC细胞的生长和增殖,增加细胞放射抵抗性。

含碳酸根羟基磷灰石剂量计材料性能稳定性的实验研究

目的研究含碳酸根羟基磷灰石(CHAP)材料的剂量学性能在不同环境条件下的稳定性。方法采用定型压片技术制备剂量计样品,样品经60Coγ线辐照后分别贮存于不同温度、湿度和不同光照背景条件下,采用电子自旋共振(ESR)技术定量分析辐射诱发的自由基。结果在实验观测的3个月内,样品在4℃或室温下保存,信号变化均<3%;40℃保存时,信号变化约13%;室温下当湿度<36%时,信号变化<2%;湿度为76%的高湿度组,信号变化约8%;但高温高湿条件下信号强度并未明显衰减。样品在室温下避光存放1年以上,其信号变化<4.8%。平均照度1600 lux条件下,信号变化<3.8%;在避光条件下,信号变化<3.4%。结论在室温自然环境条件下,该剂量计材料剂量学性能变化不明显,即使较强光照对自由基信号的影响也不显著,长期储存未见信号明显衰减,但高温或高湿环境对样品的测量过程有一定影响,在未来应用中应予以考虑。

γ射线照射BEP2D细胞诱导表达的外泌体miRNA的鉴定和功能生物信息学分析

目的 识别鉴定γ射线照射细胞外泌体中放射诱导表达的miRNA分子，为揭示放射损伤旁效应机制提供新的线索。方法 60Co γ射线照射人支气管上皮细胞BEP2D，超高速离心法分别从2 Gy照射细胞和对照细胞的培养液上清中收集外泌体，用电子显微镜鉴定外泌体，miRNA芯片杂交检测分析外泌体中miRNA表达谱，qRT-PCR方法验证部分miRNA的表达变化，通过TargetScan、miRanda、GO和KEGG等生物信息学技术分析预测靶基因及其相关功能通路。结果BEP2D细胞2 Gy照射后4 h的外泌体中miRNA表达与对照组相比，共鉴定了16个表达水平显著上调的miRNA分子（P〈0.05），对其中miR-100-5p、miR-1246、miR-29b-3p、miR-7-5p在外泌体中表达上调通过定量RT-PCR得到进一步的验证。同时，还分析了上述4个miRNA在受照细胞内的表达变化，结果显示除miR-7-5p外其余3个miRNA分子在照射后2 h表达上升，4 h时后均显著降低，而此时外泌体中相应miRNA的表达是显著增加的。生物信息学分析结果表明，这些miRNA可能通过调控细胞粘附、蛋白磷酸化修饰、mTOR信号通路、染色质修饰以及DNA损伤的HR和NHEJ修复等信号通路来参与细胞辐射旁效应过程。结论 鉴定了辐射诱导BEP2D细胞外泌体中差异表达miRNAs分子，这些miRNA的靶基因参与细胞重要的生物学过程和功能信号通路，为揭示辐射诱导旁效应的机制提供了新的线索。

补体在放射性肺损伤中的作用与机制

目的探明补体在^(60)Coγ射线单次20 Gy胸部照射所致小鼠放射性肺损伤中的作用。方法^(60)Coγ射线单次20 Gy胸部照射C57BL/6小鼠,观察早期(15 d内)肺组织炎性反应和后期(30 d、180 d)肺纤维化,ELISA测定照射后1 d、3 d、7 d、15 d、30 d、180 d肺组织C2、C3a、C4、C5b-9含量,RT-PCR检测Beas-2B细胞照射后补体mRNA的表达。结果照射后小鼠放射性肺损伤表现为早期炎性反应和晚期纤维化。补体C2、C4和C5b-9复合物在照射后早期(3 d或7 d)增高(P<0.05),可能与照射引起的炎性反应有关。补体C3a在照射后3~180 d均明显高于对照组水平,提示其与放射性肺损伤关系密切。照射细胞中,补体C2、C3的mRNA表达增高,而C4、C5的mRNA水平无变化。结论不同补体在放射性肺损伤中的反应存在差异,其中补体C3a与放射性肺损伤关系极为密切,提示通过调控补体C3a及其受体可能是防治放射性肺损伤的新途径。

miR-375-3p抑制DNA双链断裂的同源重组修复增强结直肠癌细胞放射敏感性的研究

目的探究miR-375-3p调控结直肠癌细胞放射敏感性的作用和机制。方法在结直肠癌细胞HCT116及HT29中过表达miR-375-3p,利用CCK-8法检测细胞增殖能力,利用克隆形成实验检测细胞克隆形成能力,利用Annexin V-FITC/PI双染法流式细胞术检测细胞凋亡,利用流式细胞术检测细胞周期分布。过表达miR-375-3p后,检测γ-H2AX foci形成点数量、同源重组(HR)及非同源性末端连接(NHEJ)修复效率,分析miR-375-3p表达对DNA双链断裂(DSBs)以及其修复效率的影响;利用生物信息学预测miR-375-3p在HR修复通路中的下游靶基因,利用双荧光素酶报告基因法进一步验证miR-375-3p表达对靶基因重组蛋白A(RAD51)表达调控作用。最后,利用荧光定量PCR技术检测经^(60)Coγ射线2、6 Gy照射后HCT116细胞miR-375-3p的表达量;抑制miR-375-3p表达,经0、1、2、4、6 Gy不同剂量照射后,分析miR-375-3p表达变化对结直肠癌细胞HCT116放射敏感性的影响。结果过表达miR-375-3p显著抑制了结直肠癌细胞HCT116及HT29的增殖及克隆形成能力,诱发其细胞凋亡、G1期周期阻滞和DSBs损伤,下调了Rad51表达,显著降低了HR修复效率[miR-375-3p(3.55±0.30)%,miR-nc(1.97±0.15)%;t=10.055,P<0.05];双荧光素酶报告基因实验显示miR-375-3p能够靶向Rad513′UTR区域结合(t=5.013,P<0.05);电离辐射能诱导miR-375-3p表达,抑制其表达显著降低了结直肠癌细胞放射敏感性(t=6.460、5.619、10.150,P<0.05)。结论miR-375-3p能够靶向抑制Rad51表达,下调DSBs的HR修复效率,增强结直肠癌细胞的放射敏感性。

基于机器学习的在体电子顺磁共振波谱分类和辐射剂量预测方法研究

核与辐射突发事件发生后,在体电子顺磁共振(in-vivo EPR)方法可对伤员辐射剂量进行现场、快速、无创检测。对in-vivo EPR波谱分析,目前常采用人工标记峰值并计算信号强度,存在工作量大、受主观因素干扰等问题。本研究利用支持向量机(SVM)技术,建立了一种对in-vivo EPR波谱进行自动分类识别的方法,可批量自动识别并筛除in-vivo EPR测量时因振动、牙表面水干扰而产生的无效波谱。本研究利用遗传算法优化神经网络(GA-BPNN)建立了一种波谱分析方法,可对in-vivo EPR波谱中的辐射诱发信号进行自动识别,并预测伤员受到辐射的剂量。实验结果表明,本研究建立的SVM和GA-BPNN波谱处理方法可有效地完成in-vivo EPR波谱自动分类和剂量预测,可满足核事故应急剂量评估的需求。本研究探索了机器学习方法在电子顺磁共振(EPR)波谱处理领域的应用,提高了EPR波谱处理的智能化水平,为提升大批量EPR波谱处理效率提供了支撑。

人Cdc25B基因启动子报告基因载体的构建及转录活性分析

目的构建人细胞分裂周期25家族蛋白B(Cdc25B)基因启动子(promoter)荧光素酶报告基因载体p GL3-Cdc25B-promoter,并检测其转录活性。方法应用欧洲启动子在线数据库(EPD)获得人Cdc25B基因5'端非编码区处包含转录起始位点在内的-2000^+100的DNA序列。以正常人全血基因组DNA为模板,利用PCR扩增该序列,并插入到p GL3-Basic荧光素酶报告基因载体上。通过设计不同引物,进一步构建系列缺失体,共获得7个不同长度启动子序列的报告基因载体。将其与内参质粒pRL-TK瞬时共转染He La细胞,通过双荧光素酶报告基因活性测定实验检测不同缺失体的转录活性。利用定点突变及RNA干扰(RNAi)探究预测的转录因子对Cdc25B转录活性的影响。结果构建的人Cdc25B基因启动子荧光素酶报告基因载体p GL3-Cdc25B-promoter经酶切鉴定及测序结果比对完全正确,将其转染He La细胞后,检测到荧光素酶高表达(P<0.05)。启动子系列缺失分析显示-160^-53片段包含基本核心启动子,与生物信息学的预测结果一致。定点突变及RNA干扰显示NF-YB转录因子对Cdc25B起正调控作用。结论成功构建了7个具有转录活性的人Cdc25B启动子缺失片段,确定了NF-YB是Cdc25B转录的一个重要调控因子,为进一步将其用于抗肿瘤药物的筛选与评价奠定了基础。

^(60)Co γ线照射血管内皮细胞外泌体中miRNA的鉴定分析

目的利用微小RNA(miRNA)芯片和生物信息学技术,研究受照射人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)产生的外泌体miRNA组分的变化,为揭示血管组织放射损伤及其旁效应机制提供新的线索。方法超高速离心法收集对照组和4 Gy剂量照射组的HUVEC外泌体,运用电镜及Western印迹技术对外泌体进行鉴定,miRNA芯片技术分析细胞内和外泌体中miRNA表达谱,qRT-PCR法验证部分差异miRNA,通过miRDB和Target Scan预测差异miRNA的靶基因,DAVID、KEGG等在线工具进行生物信息学分析。结果 HUVEC经4 Gy照射后外泌体miRNA与对照组相比,照后0.5 h共鉴定到18个发生表达变化的miRNA分子,5个表达上调,13个表达下调;照后2 h鉴定出16个表达上调、5个表达下调miRNA分子;细胞内miRNA与对照组相比,照射后0.5、2 h分别有38个和85个差异表达miRNA,且差异有统计学意义(P<0.01)。生物信息学结果表明,这些表达变化的miRNA可能通过参与调控MAPK、Ras、PI3K-Akt信号通路等途径影响细胞辐射旁效应。结论电离辐射损伤导致血管内皮细胞外泌体miRNA分子组分和表达水平发生显著改变,这些miRNA的靶基因组产物在细胞放射损伤反应的信号通路调节中发挥重要作用。

DC细胞在辐射损伤抗原递呈及T细胞活化中的作用

目的利用体外细胞共培养技术模拟体内肺组织微环境,探索树突状细胞(DC)在辐射损伤细胞的抗原提呈作用。方法^(60)Coγ射线照射的小鼠肺上皮细胞(MLE-12)与骨髓来源DC和/或脾T淋巴细胞培养48 h,流式细胞术检测DC细胞共刺激分子CD80/86和抗原肽识别复合物MHCⅠ/Ⅱ表达水平,T细胞活化标志CD69/28/152表达水平以及CD4^(+)和CD8^(+)亚群细胞数。结果^(60)Coγ射线照射的MLE-12细胞凋亡率呈剂量依赖性增高,明显刺激DC细胞CD80/86和MHC II表达,但对T细胞无直接活化作用;6 Gy照射的MLE-12细胞与DC细胞和T淋巴细胞共培养48 h,T细胞CD69和CD28表达增加,CD4^(+)和CD8^(+)亚群细胞数均明显高于对照组,同时DC细胞出现CD86和MHCI特异性高表达。结论辐射损伤细胞可刺激DC细胞抗原提呈功能,并对T细胞进行活化。

DNA依赖性蛋白激酶催化亚基在电离辐射诱发HeLa细胞自噬中的作用

目的了解DNA依赖性蛋白激酶催化亚基(DNA-PKcs)在电离辐射诱发细胞自噬中的作用。方法通过慢病毒载体(p SicoR)构建DNA-PKcs短发夹RNA(shRNA)表达载体,并转染HeLa细胞敲低DNA-PKcs表达。CCK-8实验检测细胞增殖活性及细胞放射敏感性,免疫印迹检测自噬相关蛋白表达,免疫荧光实验检测自噬标志物GFP-LC3的表达。结果成功构建shRNA敲低DNA-PKcs表达的HeLa细胞模型,通过该细胞模型观察到抑制DNA-PKcs蛋白表达导致细胞增殖能力降低、放射敏感性增高。P62和LC3蛋白表达变化,以及细胞内绿色荧光蛋白(GFP)-LC3免疫荧光斑检测结果显示,DNA-PKcs基因敲低后,明显增加X射线诱发细胞自噬。抑制DNA-PKcs导致哺乳动物西罗莫司(雷帕霉素)靶蛋白(mTOR)第2481位丝氨酸磷酸化水平降低。结论抑制DNA-PKcs增强受照射宫颈癌HeLa细胞的自噬及放射敏感性,mTOR信号通路可能参与DNA-PKcs对自噬的调节作用。

用于铀污染去除的接枝4-磺酸杯[6]芳烃的棉纤维制备

目的 基于杯芳烃对铀酰离子的特异性络合作用,合成一种接枝杯芳烃磺酸基衍生物的棉纤维,用于铀污染的吸附去除。方法 采用化学接枝的方法在棉纤维上与溴异丁酰溴(BIBB)、甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)、4-磺酸杯[6]芳烃(S-C[6]a)逐步反应,通过扫描电子显微镜(SEM)、X射线光电子能谱(XPS)、红外光谱(FTIR)表征其结构。使用Franz扩散池模拟皮肤污染,激光液体荧光法测定铀含量。结果 SEM、XPS、FTIR表征结果显示棉纤维与4-磺酸杯[6]芳烃成功接枝;4-磺酸杯[6]芳烃棉纤维对硝酸铀酰溶液吸附的最适pH为4.0,时间为20 min,吸附剂用量为20 mg,吸附过程更符合伪二级动力学吸附,4-磺酸杯[6]芳烃棉纤维在溶液中的吸附率为78.46%,对皮肤铀污染的去污效率为81.72%。结论 成功合成了4-磺酸杯[6]芳烃棉纤维,且4-磺酸杯[6]芳烃棉纤维对可溶性铀的吸附和皮肤铀污染去除有显著效果。

γ射线胸部照射小鼠早期肺组织的免疫细胞反应

目的探索γ射线胸部照射小鼠早期肺组织免疫相关T淋巴细胞反应。方法将112只C57BL/6雄性小鼠[6~8周龄,(20±2)g]采用随机数字表法随机分为14组(照射组和对照组各7组),每组8只。照射组小鼠进行单次20 Gy 60Coγ射线胸部照射,分别在照射后第3、12小时和第1、2、3、7、14天用流式细胞仪检测肺组织的白细胞、T淋巴细胞(CD3+)及其CD4+和CD8+亚群、调节性T细胞(Treg)等免疫细胞比例的变化。两组间比较采用t检验。结果照射后的小鼠肺组织白细胞显著降低(t=3.446~7.781,均P<0.01);CD3+T细胞在照射后早期(第3小时至第2天)降低明显(t=4.413~15.430,均P<0.01);Treg(CD4+CD25+Foxp3+)显著升高(t=2.813~4.406,均P<0.05);CD4+在照射后早期(第3小时和第12小时)减少(t=5.019、4.912,均P<0.01),1 d后恢复至对照组水平;CD8+在照射后早期(第3小时和第12小时)无明显变化,第1天和第3天降低明显(t=6.736、4.738,均P<0.01),第7天后升高(t=7.537、3.903,均P<0.01);CD4+/CD8+比值在照射后12 h内降低(t=5.624、4.083,均P<0.01),第1天和第3天升高明显(t=13.410、5.702,均P<0.01),但7 d后又下降(t=5.505、3.928,均P<0.01)。结论胸部照射小鼠早期肺组织免疫相关细胞呈现各种不同变化,这可能与辐射导致免疫细胞损伤以及机体应激反应产生的免疫应答有关。

TGF-β3对辐射致肺上皮细胞损伤的保护作用及其机制研究

目的探索转化生长因子-β3(TGF-β3)在辐射致肺上皮细胞损伤中的作用及其可能机制,为放射性肺损伤的防治提供实验依据。方法设计合成并筛选Ⅱ型转化生长因子-β受体(TGFBR2)的小干扰RNA(siRNA),用于细胞TGFBR2干涉;将体外培养的人支气管上皮细胞(Beas-2B细胞)及其TGFBR2干涉细胞随机分为对照组、5 ng/ml TGF-β3处理组(TGF-β3组)、6 Gy60Co-γ射线单次照射组(6 Gy组)、6 Gy60Co-γ射线单次照射+5 ng/ml TGF-β3处理组(6 Gy+TGF-β3组),采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测各组胶原蛋白和TGFBR2的表达,RT-qPCR和Western印迹检测上皮间质转化(EMT)相关标志物平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达;流式细胞术分析细胞凋亡和细胞周期。结果(1)TGF-β3对辐射诱发的细胞胶原蛋白表达增高有明显抑制作用,并可降低辐射所致细胞EMT相关标志物α-SMA基因和蛋白水平的异常高表达,有效保护辐射所致肺组织细胞纤维化改变;(2)TGF-β3可抑制辐射诱导的细胞TGFBR2异常高表达,并对辐射诱发的细胞凋亡和细胞周期G2/M期阻滞均有明显保护作用;(3)对细胞TGFBR2干涉后,TGF-β3对辐射所致细胞凋亡和细胞周期G2/M期阻滞的保护作用丧失,抑制辐射所致肺上皮细胞损伤。结论TGF-β3通过TGFBR2保护辐射损伤的肺上皮细胞。