目的通过验证异柠檬酸裂解酶（isocitratelyase，Icl）蛋白在缺氧和营养缺乏等应激条件下的原核类泛素蛋白（prokaryotic ubiquitin like protein，Pup）化状态的变化，进而说明Pup一蛋白酶体系统对其进行动态调控。方法构建耻垢分枝杆...目的通过验证异柠檬酸裂解酶（isocitratelyase，Icl）蛋白在缺氧和营养缺乏等应激条件下的原核类泛素蛋白（prokaryotic ubiquitin like protein，Pup）化状态的变化，进而说明Pup一蛋白酶体系统对其进行动态调控。方法构建耻垢分枝杆菌Icl蛋白表达载体，纯化蛋白，制备Icl抗体；构建持续表达His6-Pup的穿梭载体，导人耻垢分枝杆菌中；分别在有氧，缺氧条件（2、4和6d）培养，营养缺乏条件（2、4、6和8d）培养，收集耻垢分枝杆菌菌体，超声破碎后获得总蛋白，通过Ni—NTA柱纯化，获得His6-Pup结合的蛋白；跑SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），转膜后做免疫印迹（Western—blot）实验，分别用抗Pup抗体和抗Icl抗体检测，验证Icl蛋白的表达情况及其被Pup化的状况，所有实验均重复3次。结果发现在缺氧和营养缺乏条件下Icl蛋白的表达呈现增加的趋势，而Pup化的程度有下降的趋势，Pup化和蛋白浓度变化趋势是相反的。说明细胞在应激条件下需要Icl高表达，因而Pup蛋白酶体系统对其降解程度选择性的下降，相应提高了细胞内Icl蛋白的浓度，满足细胞在应激反应中的需要。结论Icl在分枝杆菌细胞的应激过程中发挥重要作用，其浓度随着细胞本身的状态而发生动态变化，这主要是Pup-蛋白酶体系统对它的降解调控发生变化，说明Pup可以动态调控Icl蛋白的浓度水平。展开更多
文摘目的通过验证异柠檬酸裂解酶（isocitratelyase，Icl）蛋白在缺氧和营养缺乏等应激条件下的原核类泛素蛋白（prokaryotic ubiquitin like protein，Pup）化状态的变化，进而说明Pup一蛋白酶体系统对其进行动态调控。方法构建耻垢分枝杆菌Icl蛋白表达载体，纯化蛋白，制备Icl抗体；构建持续表达His6-Pup的穿梭载体，导人耻垢分枝杆菌中；分别在有氧，缺氧条件（2、4和6d）培养，营养缺乏条件（2、4、6和8d）培养，收集耻垢分枝杆菌菌体，超声破碎后获得总蛋白，通过Ni—NTA柱纯化，获得His6-Pup结合的蛋白；跑SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），转膜后做免疫印迹（Western—blot）实验，分别用抗Pup抗体和抗Icl抗体检测，验证Icl蛋白的表达情况及其被Pup化的状况，所有实验均重复3次。结果发现在缺氧和营养缺乏条件下Icl蛋白的表达呈现增加的趋势，而Pup化的程度有下降的趋势，Pup化和蛋白浓度变化趋势是相反的。说明细胞在应激条件下需要Icl高表达，因而Pup蛋白酶体系统对其降解程度选择性的下降，相应提高了细胞内Icl蛋白的浓度，满足细胞在应激反应中的需要。结论Icl在分枝杆菌细胞的应激过程中发挥重要作用，其浓度随着细胞本身的状态而发生动态变化，这主要是Pup-蛋白酶体系统对它的降解调控发生变化，说明Pup可以动态调控Icl蛋白的浓度水平。
