应用多肽芯片研究非小细胞肺癌患者血清中的EGFR自身抗体

背景与目的自身抗体作为新的肿瘤标志物在肺癌的早期诊断和预后评价中可能发挥重要作用,本研究利用多肽芯片检测非小细胞肺癌患者血清中表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)的自身抗体,并筛选自身抗体识别的抗原表位。方法使用Intavis公司ASPSL多肽芯片合成仪合成EGFR多肽芯片,利用多肽芯片检测非小细胞肺癌患者血清中EGFR自身抗体,并筛选自身抗体识别的抗原表位。结果使用EGFR多肽芯片检测了20例非小细胞肺癌患者,结果有6例阳性,阳性率为30%,在该6例阳性患者中发现了9个高频位点,并且有8个高频位点集中在EGFR胞外段的第III和第IV结构域。结论本研究为我们进一步研究EGFR和EGFR自身抗体的功能提供了新的线索。

DKK1影响恶性肿瘤骨转移机制的研究进展

DKK1(Dickkopf-1)是一种分泌性糖蛋白,通过结合Wnt受体LRP5/6而抑制Wnt信号通路。研究表明,DKK1在乳腺癌、非小细胞肺癌、前列腺癌等多种恶性肿瘤的骨转移中发挥重要的作用,其机制可能与溶骨性病变相关。进一步研究DKK1对恶性肿瘤骨转移的影响机制具有重要的临床意义。因此,本文针对DKK1对乳腺癌、非小细胞肺癌等恶性肿瘤骨转移的影响进行综述。

肺癌血清肿瘤标志物研究进展

肺癌是当前全世界发病率和死亡率最高的恶性肿瘤。大部分患者确诊时已为晚期，失去了最佳治疗时机。近年来，虽然不断有新型的化疗药物被发现，但是肺癌五年存活率没有明显的提高。不能早期发现和诊断肺癌是导致它疗效差及高死亡率的主要原因，故提高肺癌预后的关键是早期诊断。

应用多肽芯片研究非小细胞肺癌患者血清中的EGFR自身抗体

背景与目的自身抗体作为新的肿瘤标志物在肺癌的早期诊断和预后评价中可能发挥重要作用，本研究利用多肽芯片检测非小细胞肺癌患者血清中表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）的自身抗体，并筛选自身抗体识别的抗原表位。方法使用Intavis公司ASPSL多肽芯片合成仪合成EGFR多肽芯片，利用多肽芯片检测非小细胞肺癌患者血清中EGFR自身抗体，并筛选自身抗体识别的抗原表位。结果使用EGFR多肽芯片检测了20例非小细胞肺癌患者，结果有6例阳性，阳性率为30％，在该6例阳性患者中发现了9个高频位点，并且有8个高频位点集中在EGFR胞外段的第III和第IV结构域。结论本研究为我们进一步研究EGFR和EGFR自身抗体的功能提供了新的线索。

应用SEREX技术筛选和鉴定非小细胞肺癌肿瘤相关抗原

背景与目的目前用于非小细胞肺癌诊断的标志物为数不多，为寻找更多的早期诊断和靶向治疗相关的标志物，本研究应用SEREX技术筛选与鉴定非小细胞肺癌肿瘤相关抗原。方法使用非小细胞肺癌患者血清对人肺鳞癌和腺癌噬菌体展示文库进行生物淘选和SEREX筛选。PCR扩增阳性克隆插入片段后测序，结果与GeneBank数据库中已知基因进行同源性比较，分析其生物学特性。结果用非小细胞肺癌血清对噬菌体展示文库进行筛选，共获得31个阳性克隆，测序后发现其代表15个基因，其中12个与已知cDNA序列同源，与肺癌或其它肿瘤的发生、发展关系密切；另外3个未发现有同源基因，可能是新基因。结论应用SEREX技术发现15个肺癌相关抗原和3个肺癌相关抗原的候选基因，为进一步的深入研究打下良好的基础。

Survivin与肺癌临床关系的研究进展

Survivin基因作为凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis proteins. IAP） 家族的重要成员，除了具有促进细胞转化、调控细胞周期、参与细胞有丝分裂和血管的生成等作用外，其细胞凋亡作为细胞增殖和死亡的一种重要调控机制．在肿瘤的发生、发展过程中起到了不容忽视的作用。据最新统计结果报道，

Ⅰ、Ⅱ相药物代谢酶遗传多态性与晚期非小细胞肺癌化疗疗效的关系

背景与目的目前药物代谢酶遗传多态性与化疗疗效关系的研究结果多不一致,本研究旨在探讨细胞色素P4501A1(cytochrome P450 1A1,CYP1A1)、2E1(cytochrome P450 2E1,CYP2E1)、2D6(cytochrome P450 2D6,CYP2D6)和谷胱甘肽硫转移酶M1(glutathione S-transferase M1,GSTM1)基因多态性与晚期非小细胞肺癌化疗疗效以及与肺癌患者预后的关系。方法采用PCR和PCR-RFLP技术对肺癌患者4种药物代谢酶基因分型,并对他们进行5年跟踪随访。结果携带B型CYP1A1和缺陷性GSTM1肺癌患者比其它基因型患者化疗疗效好(P<0.001)。携带A型CYP1A1肺癌患者接受非铂类化疗药物治疗比B型和C型患者疗效好(P=0.041);携带缺陷性GSTM1肺癌患者接受铂类化疗药物治疗疗效比功能型患者疗效好(P=0.011)。4种酶对晚期非小细胞肺癌患者总生存期(overall survival,OS)没有明显影响(P>0.05)。结论 A型CYP1A1肺癌患者接受非铂类化疗药物治疗比B型和C型患者疗效好;缺陷性GSTM1肺癌患者接受铂类化疗药物治疗比功能型患者疗效好。4种酶基因多态对晚期非小细胞肺癌患者OS影响没有明显统计学差异。

非小细胞肺癌T7噬菌体展示文库的构建

背景与目的SEREX(Serological analysis of recombinant expression libraries)是近年来发展起来的一种寻找肿瘤相关抗原的方法,通过与噬菌体展示技术结合,可以有效和快速的筛选肿瘤相关抗原。本研究拟构建人肺鳞癌和肺腺癌T7噬菌体展示cDNA文库,为进一步筛选和鉴定非小细胞肺癌相关抗原打下基础。方法诊断明确的肺鳞癌和腺癌患者手术标本各5例,Trizol试剂提取总RNA,Straight A's系统分离鳞癌和腺癌mRNA,逆转录合成双链cDNA后,与T7Select 10-3载体连接,体外包装并扩增得到人肺鳞癌和腺癌T7噬菌体展示cDNA文库。结果构建肺鳞癌和肺腺癌T7噬菌体展示cDNA文库各一个,原始文库重组克隆数分别为鳞癌1.8×106pfu,腺癌5×106pfu。扩增后滴度为3.2×1010pfu/mL和2.5×1010pfu/mL。随机从2个文库中各抽取24个克隆PCR扩增插入片断,电泳结果显示肺腺癌文库所有克隆均有插入片段,肺鳞癌文库插入率超过95%(23/24)。两个文库插入片断大小均在(300-1500)bp之间。结论成功构建了人肺鳞癌和腺癌T7噬菌体展示cDNA文库,为下一步筛选和鉴定非小细胞肺癌相关基因奠定基础。

Wnt蛋白生成抑制剂2对非小细胞肺癌细胞迁移与侵袭能力的影响

目的:探讨Wnt蛋白生成抑制剂2(the inhibitor of Wnt production 2,IWP2)对非小细胞肺癌细胞迁移与侵袭能力的影响。方法:体外培养非小细胞肺癌H1299和95C细胞,分为对照组(无血清培养基)及实验组(应用10μmol/L IWP2处理24或48 h)。采用划痕实验和未铺Matrigel胶的Transwell迁移实验检测IWP2对细胞迁移能力的影响;铺有Matrigel胶的Transwell侵袭实验检测IWP2对细胞侵袭能力的影响;Western blot实验检测IWP2对非小细胞肺癌细胞中β-catenin及上皮间充质转化(EMT)相关蛋白ZEB1、Snail表达的影响。结果:划痕实验结果显示,经10μmol/L IWP2处理24 h后,与对照组比较,实验组H1299和95C细胞的划痕愈合面积均明显降低(P<0.01);在Transwell迁移实验中,实验组过膜细胞数明显降低(P<0.01);Transwell侵袭实验结果显示,实验组细胞表现出更低的侵袭能力(P<0.01)。Western blot结果表明,H1299和95C细胞在经IWP2作用后,与对照组比较,β-catenin的表达水平分别降低41.3%和36.1%(P均<0.01);IWP2也抑制了EMT相关蛋白ZEB1、Snail的表达,与对照组比较,实验组H1299和95C细胞中,ZEB1的表达水平分别降低51.8%和40.9%,Snail表达水平分别降低43.2%和30.7%,差异均具有统计学意义(P均<0.01)。结论:IWP2抑制β-catenin的表达并抑制非小细胞肺癌细胞发生EMT,从而降低细胞的迁移与侵袭能力。

一种检测非小细胞肺癌患者血清中p53自身抗体的新方法

背景与目的多肽阵列是近年来发展起来的一种研究分子之间相互作用的方法。本研究拟建立多肽阵列检测非小细胞肺癌患者血清中p53自身抗体的方法,筛选p53自身抗体识别的抗原决定簇序列。方法利用点合成技术(SPOT synthesis technique)合成覆盖p53多肽链全部序列的多肽阵列;分别用ELISA和多肽阵列检测血清中的p53自身抗体,确定p53自身抗体识别的抗原决定簇序列。结果将包含p53多肽链全部序列的重叠肽段合成到硝酸纤维素膜上。多肽阵列检测30例非小细胞肺癌患者血清中的p53自身抗体,有7例为阳性;30例健康对照者均为阴性,与ELISA检测结果相同。P53自身抗体识别p53多肽链上某些共同的抗原表位。结论多肽阵列不仅可以用来检测肺癌患者血清中的自身抗体,还可以筛选这些自身抗体识别的抗原表位,为下一步研究自身抗体与非小细胞肺癌的早期诊断和预后的关系奠定基础。

p53调控的肺癌细胞顺铂敏感性相关基因片段的分离和克隆

目的 克隆野生型 p5 3 (wtp5 3 )影响人大细胞肺癌 80 1 D细胞系顺铂敏感性相关基因片段。 方法 采用转基因方法补偿 80 1 D细胞p5 3功能 ,分别提取经IC50 浓度顺铂刺激的转染wtp5 3细胞、空载细胞和未经顺铂作用的转wtp5 3细胞RNA ,用银染mRNA差异显示方法分离差异表达基因 ,反转录点杂交和巢式PCR进行确证。阳性片段进行克隆及序列分析。结果 获得 6条阳性片段 ,2条含有开放阅读框架(ORF) ,其中 1条片段部分与核糖核苷还原酶α链有 5 6%同源性 ,另一片段D1含有一个长ORF ,与已知cDNA序列同源率低。结论 p5 3对 80 1 D细胞顺铂敏感性的影响有明显的基因水平改变 ,可能诱导了相关基因表达。

PI3K/Akt/mTOR信号转导途径与非小细胞肺癌的关系

背景与目的PI3K/Akt/mTOR通路失调对肺癌形成可能具有重要作用，本研究通过分析非小细胞肺癌组织中PI3K/Akt/mTOR信号转导途径中VEGF,PI3K,Akt，mTOR基因的表达水平，探讨PI3K/Akt/mTOR信号转导途径与非小细胞肺癌之间的关系。方法外科手术中获取40例非小细胞肺癌组织及30例癌旁组织，应用逆转录聚合酶链反应（reverse transcriptase polymerase chain reaction,RT—PCR）技术检测癌及癌旁组织中VEGF,PI3K,Akt，mTOR基因的表达水平。结果非小细胞肺癌组织中VEGF，PI3K，Akt，mTOR基因的表达水平分别为（40±59）％、（61±23）％，（77±32）％，（43±21）％，癌旁组织中VEGF,PI3K,Akt、roTOR基因的表达水平分别为（16±40）％、（23±16）％、（10±12）％、（20±17）％，非小细胞肺癌组织中VEGF、PI3K，Akt，mTOR基因的表达水平均高于癌旁组织（P〈0．01）。联合应用4个基因表达作为NSCLC诊断标志，诊断的敏感性达到87．5％，特异性为90％。结论非小细胞肺癌中PI3K／Akt／mTOR信号转导途径相关基因表达水平明显上调，说明该通路在非小细胞肺癌中被激活． 联合检测VEGF、PI3K、Akt、mTOR的表达水平改变可能作为NSCLC的诊断标志。

Si-10靶点对不同COX-2蛋白表达状态肺癌细胞体外恶性增殖的影响

目的研究si-10靶点对不同环氧化酶-2（COX-2）蛋白表达状态肺癌细胞干扰效果及对肺癌细胞恶性增殖的影响。方法将psi-10及空载体（pEGFP）分别转染到不同COX-2表达状态的肺癌细胞，建立转染细胞株。采用反转录聚合酶链反应和蛋白质印迹方法检测COX-2表达水平的变化。通过细胞生长曲线、集落形成验研究这-靶点对肺癌细胞体外恶性增殖的影响。结果转染后24、48和72h，转守载体的细胞均有绿色荧光表达，转染psi-10的801D、A549和LTEP-A2细胞均未观察到绿色荧光。在A549和IJTEP-A2细胞中COX-2表达均受到抑制，但抑制效果不同，与A549细胞比较si-10对LTEP-A2细胞COX-2表达抑制更为明显。与其母系比较，LTEP-A2-10和A549-10细胞COX-2mRNA表达量分别降低64．2％和61．2％；COX-2蛋白表达量分别降低60．2％和56．2％。LTEP-A2-10和A549-10细胞生长明显减慢，集落形成率减少。与A549-10细胞比较，LTEP-A2-10细胞生长更慢，集落形成率更低，集落更小。si-10靶点对COX-2不表达的801D细胞生长没有抑制作用。结论si10对不同COX-2基因表达的肺癌细胞有不同的干扰效果，而不同干扰的效果对细胞的恶性增殖有着不同的抑制作用。

RNA干扰环氧化酶-2基因表达对A549细胞体外恶性增殖的影响

目的研究不同靶点对环氧化酶-2（COX-2）基因表达的抑制及其对A549细胞体外恶性增殖的影响。方法以COX-2第3、7和10外显子为靶点，构建3个带有人U6启动子的COX-2小干扰RNA（siRNA）表达载体。用脂质体lipofectamine介导，分别将3个siRNA表达载体及2个空载体转染到cox-2表达阳性的A549细胞，建立转染细胞株。采用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）和Western blot方法检测COX-2表达水平的变化。通过细胞生长曲线、集落形成试验研究COX-2不同干扰靶点对A549细胞体外增殖的影响。结果3个siRNA和u6启动子序列正确并准确克隆到pEGFP载体。转染细胞株分别命名为A549—3，A549—7、A549—10、A549-p和A549-pU6。转染后24、48、72h，A549-p细胞均有绿色荧光表达，而A549-pU6、A549-3、A549—7和A549—10细胞均未观察到绿色荧光。RT—PCR和Western blot结果显示，以COX-2第3、7和10外显子作为靶点进行干扰，COX-2表达均受到抑制。与A549细胞比较，A549—3、A549-7、A549-10细胞的COX-2 mRNA表达量分别降低10．6％、33．4％和61．2％，COX-2蛋白表达量分别降低26．7％、44．7％和56．2％。细胞生长曲线、集落形成试验的结果显示，A549—10细胞生长减慢，集落形成率减少，而3外显子和7外显子两个干扰靶点对A549细胞生长没有明显的影响。结论以COX-2第10外显子为靶点干扰效果最好，对A549细胞的体外恶性增殖有明显的影响。

干扰COX-2基因表达对人肺腺癌A2细胞体外恶性增殖的影响

背景与目的COX-2在多种肿瘤组织中高表达，参与了肿瘤的发生发展，RNA干扰（RNAi）技术是一种经济、快捷、高效的抑制特异基因表达的技术手段。本研究应用RNAi技术研究干扰COX-2基因表达的抑制效果及抑制COX-2基因表达对A2细胞体外恶性增殖的影响。方法以COX-2为靶点，构建3个带有人u6启动子的COX－2小干扰RNA（short interfering RNA，siRNA）表达载体。用脂质体lipofectamine介导，分别将3个siRNA表达载体及空载体转染到COX-2表达阳性的A2细胞，建立转染细胞株。采用反转录聚合酶链反应（RT－PeR）和Western blot方法检测COX-2表达水平的变化。通过细胞生长曲线、集落形成试验研究干扰COX-2基因表达对A2细胞体外增殖的影响。结果经过PCR扩增、内切酶鉴定、DNA测序和BLAST比对证实3个siRNA和u6启动予序列正确并准确克隆到pEGFP载体。转染细胞株分别命名为A2－3、A2—7、A2—10和A2－P。转染后24h、48h、72h，A2－P细胞均有绿色荧光表达．而A2—3、A2-7、A2－10细胞均未观察到绿色荧光。RT-PCR和Western blot结果显示，3个siRNA表达载体均发挥作用，COX～2表达受到抑制。与A2细胞比较，A2－3、A2－7、A2－10细胞的COX－2mRNA表达量分别降低15．6％、20．4％和64．2％，COX－2蛋白表达量分别降低23．7％、36．7％和60．2％。缀胞生长曲线、集落形成试验的结果显示，A2—10细胞生长减慢，集落形成率减少，而A2—3和A2-7细胞生长没有明显的改变。结论应用RNAi技术熄灭COX-2基因表达对A2细胞的体外恶性增殖有明显的抑制作用。

I、Ⅱ相药物代谢酶遗传多态性与晚期非小细胞肺癌化疗疗效的关系

目的目前药物代谢酶遗传多态性与化疗疗效关系的研究结果多不一致，本研究旨在探讨细胞色素P4501A1（cytochromeP4501A1，CYPlAl）、2El（cytochromeP4502El，CYP2E1）、2D6（cytochromeP4502D6，CYP2D6）和谷胱甘肽硫转移酶M1（glutathioneS-transferaseM1，GSTMI）基因多态性与晚期非小细胞肺癌化疗疗效以及与肺癌患者预后的关系。方法采用PCR和PCR．RFLP技术对肺癌患者4种药物代谢酶基因分型，并对他们进行5年跟踪随访。结果携带B型CYPlAl和缺陷性GSTMl肺癌患者比其它基因型患者化疗疗效好（P＜0．001）。携带A型CYPlAl肺癌患者接受非铂类化疗药物治疗比B型和C型患者疗效好（P=0．041）；携带缺陷性GSTMl肺癌患者接受铂类化疗药物治疗疗效比功能型患者疗效好（P=O．011）。4种酶对晚期非小细胞肺癌患者总生存期（overallsurvival，OS）没有明显影响（R，O．05）。结论A型CYPIAI肺癌患者接受非铂类化疗药物治疗比B型和C型患者疗效好；缺陷性GSTMl肺癌患者接受铂类化疗药物治疗比功能型患者疗效好。4种酶基因多态对晚期非小细胞肺癌患者OS影响没有明显统计学差异。

mTOR和PTEN在非小细胞肺癌组织中的表达及临床意义

背景与目的mTOR是调节细胞生长和增殖的重要信号转导分子，也是一种蛋白激酶。它通过活化下游的相关的效应蛋白发挥作用。在信号转导通路中PTEN基因可通过对该信号途径的负调控而抑制mTOR的活化。本研究通过分析mTOR信号转导途径中mTOR和PTEN基因在非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）组织中的表达和临床意义。方法外科手术中获取65例NSCLC组织及30例癌旁组织，RT—PCR技术检测NSCLC组织及癌旁组织中mTOR和FFEN基因的表达水平。结果mTOR在NSCLC组织中表达量（0．23±0．16）显著高于癌旁组（0．12±0．09）（P〈0．01），PTEN在NSCLC组织中表达量（0．19±0．28）显著低于癌旁组（O53±0．28）（P〈0．01）。mTOR和PTEN与病人的性别、年龄、病理类型、淋巴结转移情况无关，与病人的肿瘤大小有关。结论mTOR在NSCLC中被激活，PTEN在NSCLC组织表达缺失或减少，mTOR通路的激活和PTEN表达缺失在NSCLC发生发展中起到一定的作用。

多肽微阵列筛选技术在肺结核诊断中的应用

目的血清免疫学技术广泛用于肺结核检测，但已有的血清标志物其敏感性和特异性还有待提高，需要发掘新的血清标志物。方法利用多肽微阵列技术解析结核菌抗原PPE．FAMILY（RV2430c），SodC（Rv0432）和TrxC（Rv3913）全长蛋白质多肽序列，获得蛋白抗原表位多肽。进行两轮筛选，寻找结核病优势抗原多肽。利用ELISA进行验证，并将多肽与融合全蛋白进行检测效能的比较。结果筛选和验证出一条来自TrxC的抗原多肽，用于ELISA检测肺结核的敏感性和特异性分别是65％和80％，ROC曲线下面积为O．789，比用融合蛋白检测效果更优。结论多肽微阵列在寻找新的肺结核血清标志物方面具有很强的应用前景。

一种检测非小细胞肺癌患者血清中p53自身抗体的新方法

背景与目的多肽阵列是近年来发展起来的一种研究分子之间相互作用的方法。本研究拟建立多肽阵列检测非小细胞肺癌患者血清中p53自身抗体的方法，筛选p53自身抗体识别的抗原决定簇序列。方法利用点合成技术（SPOT synthesis technique）合成覆盖p53多肽链全部序列的多肽阵列；分别用ELISA和多肽阵列检测血清中的p53自身抗体，确定p53自身抗体识别的抗原决定簇序列。结果将包含p53多肽链全部序列的重叠肽段合成到硝酸纤维素膜上。多肽阵列检测30例非小细胞肺癌患者血清中的p53自身抗体，有7例为阳性，30例健康对照者均为阴性，与ELISA检测结果相同。P53自身抗体识别p53多肽链上某些共同的抗原表位。结论多肽阵列不仅可以用来检测肺癌患者血清中的自身抗体，还可以筛选这些自身抗体识别的抗原表位，为下一步研究自身抗体与非小细胞肺癌的早期诊断和预后的关系奠定基础。

非小细胞肺癌T7噬菌体展示文库的构建

背景与目的SEREX（Serological analysis of recombinant expression libraries）是近年来发展起来的一种寻找肿瘤相关抗原的方法，通过与噬菌体展示技术结合，可以有效和快速地筛选肿瘤相关抗原。本研究拟构建人肺鳞癌和肺腺癌T7噬菌体展示cDNA文库，为进一步筛选和鉴定非小细胞肺癌相关抗原打下基础。方法诊断明确的肺鳞癌和腺癌患者手术标本各5例，Trizol试剂提取总RNA，Straight A’s系统分离鳞癌和腺癌mRNA，逆转录合成双链cDNA后，与T7Select10-3载体连接，体外包装并扩增得到人肺鳞癌和腺癌T7噬菌体展示cDNA文库。结果构建肺鳞癌和肺腺癌T7噬菌体展示cDNA文库各一个，原始文库重组克隆数分别为鳞癌1．8×10^5pfu，腺癌5×10^6pfu。扩增后滴度为3．2×10^10pfu／ml和2．5×10^10pfu／ml。随机从2个文库中各抽取24个克隆PCR扩增插入片断，电泳结果显示肺腺癌文库所有克隆均有插入片段，肺鳞癌文库插入率超过95％（23／24）。两个文库插入片断大小均在300～1500bp之间。结论成功构建了人肺鳞癌和腺癌T7噬菌体展示cDNA文库，为下一步筛选和鉴定非小细胞肺癌相关基因奠定基础。