人肿瘤细胞与正常细胞内微管的PAP免疫酶细胞化学观察

我们利用兔抗微管蛋白抗体和兔抗辣根过氧化物酶(HRP)抗血清制备的HRP—抗HRP(PAP)复合物,建立了微管的PAP免疫酶细胞化学方法。应用此法观察到人食管癌ECa 109、胃癌SGC 7901,乳腺癌MCF 7和成骨肉瘤OS 732细胞间期胞质微管减少或消失,只有大量弥散分布的微管蛋白棕色反应产物,在微管组织中心(MTOC)附近十分密集,而正常成纤维细胞和胎儿胃粘膜上皮细胞间期,都有发达的胞质微管结构(CMTC)。在分裂期,这些肿瘤细胞都显示纺锤体微管,与正常细胞比较无明显差异。本研究应用PAP方法进一步证明,以前用免疫荧光细胞化学方法观察到的人肿瘤细胞间期胞质微管缺陷的特征。除去低温(4℃)或秋水仙酰胺处理后,解聚的CMTC又可恢复,表明本方法与免疫荧光染色法,同样具有很高的特异性。本工作在细胞固定及免疫反应的某些步骤上有所改进。

钙调蛋白拮抗剂对人胃癌细胞效应机理的研究——钙调蛋白与磷酸二酯酶活性测定分析*

我们曾经证明钙调蛋白(Calmodulin,CaM)拮抗剂三氟拉嗪(Trifluoperazine,TFP)有抑制人胃癌细胞增殖和诱导细胞形态向正常分化的效应。本文用CaM活性测定箱方法测定了TFP处理的人胃癌MGC-803细胞胞质内的CaM活性。同时也测定了磷酸二酯酶(Phosphodiesterase.PDE)活性的变化。结果表明TFP选择性抑制胞质内依赖Ca^(2+)/CaM的PDE活性。氨茶碱有抑制CaM活化PDE的作用。本文对TFP作用机理及在调控癌细胞增殖及分化中的意义进行讨论。

黄芫花提取物对V_(79)细胞和WB肝细胞的生物学效应 1.细胞连接通讯与增殖活性的相关性变化

用SLDT技术、细胞生长曲线、~3H-TdR掺入、细胞分裂指数和流式细胞光度术等方法在V_(79)细胞和WB肝细胞中观察到中药促癌物黄芫花提取物刺激细胞增殖的作用与对细胞GJIC抑制的作用有平行相关性。黄芫花提取物抑制V_(79)细胞的GJIC,同时刺激DNA合成,使细胞周期M期时相百分比升高,与TPA的效应相似,对黄芫花提取物促癌作用机理、GJIC抑制与细胞增殖周期的相关性进行分析讨论。

采用FRAP技术研究细胞膜分子侧向运动在细胞癌变和“逆转”中的调控机理

细胞膜领域的研究,自70年代以后一个根本性变革就是从静态研究转向动态性研究。细胞膜分子的二维运动不仅仅是细胞二维信息传递的决定者,而且潜有代谢通道,能量通道等。膜分子的运动状态,借助动力学分析可探讨在细胞生长、分化过程的膜结构、膜功能的关系。

腺苷环化酶的细胞化学定位研究(光学显微镜和电子显微镜):事实和假像

本工作对大鼠肾及小鼠十二指肠等进行了光学显微镜下腺苷环化酶的细胞化学研究;并在大鼠肾、颌下腺及肝等组织进行了电镜细胞化学定位的观察。采用ATP和特异性底物AMP-PNP显示腺苷环化酶的活性。实验结果表明:(1)温育在含有和不含有底物的孵育液中,电镜下均观察到在组织的相同部位呈现出黑色电子密度沉淀,这种沉淀物的出现对戊二醛固定较为敏感。光学显微镜下,经不加底物的孵育液温育的切片均为阴性反应。(2)孵育液内加入腺苷环化酶的激活剂(氟化钠)或抑制剂(四氧嘧啶),其反应沉淀物的出现均无明显变化。(3)在碱性磷酸酶含量较高的组织(肾、十二指肠)中,以AMP-PNP为底物,在光学显微镜下观察到有碱性磷酸酶反应的干扰。(4)组织小块或冰冻切片经煮沸加热处理后,在光学显微镜和电镜下均不出现沉淀物。我们的实验结果进一步对R-H氏显示腺苷环化酶的细胞化学方法的有效估价表示怀疑。

自发永生性转化人胚肺上皮细胞系HLEC的建立及鉴定

目的 对源自人胚肺组织原代培养、形态似上皮类型的细胞系———人肺上皮细胞(HLEC)的生物学特 性进行鉴定,为相关研究和应用提供模型和依据。 方法 分别采用相差显微镜下观察、细胞计数、β 半乳糖苷酶 染色、免疫荧光细胞化学。人Alu序列PCR扩增、染色体计数、软琼脂集落形成实验和裸鼠致瘤实验对HLEC的形 态学特征、生长特性、衰老状态、上皮细胞标志物、来源、细胞遗传学特点和恶性转化等生物学特性进行研究鉴定。 结果 HLEC角蛋白和上皮型细胞间黏附分子钙黏着素E cadherin免疫荧光染色阳性,染色体众数在41～44,人 Alu序列PCR扩增结果阳性,β 半乳糖苷酶阳性细胞的比例未见随细胞代数的增加而升高,软琼脂和裸鼠体内均不 生长,微丝及黏着斑结构正常。 结论 HLEC细胞具有永生化细胞特征、属相对正常人肺上皮亚二倍体细胞,可 用于肺癌癌变机理研究和癌细胞的相对正常对照。

小鼠抗人前B细胞白血病同源盒基因3多克隆抗体的制备与鉴定

目的制备前B细胞白血病同源盒基因3(PBX3)多克隆抗体。方法采用反转录PCR扩增PBX3基因区序列,并重组入原核表达载体pGEX-4T-1,重组载体转化BL21大肠杆菌,异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导GST-PBX3融合蛋白的表达。SDS-PAGE纯化融合蛋白,并用GST-PBX3融合蛋白免疫BALB/c小鼠,收集经过免疫的小鼠血清即抗PBX3的多克隆抗血清,采用间接ELISA检测其效价,通过免疫细胞化学技术及Western blot法鉴定其特异性。结果成功构建pGEX-4T-1/PBX3原核表达载体,转化BL21菌株后可高效表达GST-PBX3融合蛋白,且以不可溶包涵体形式存在。SDS-PAGE纯化蛋白并免疫小鼠产生的抗PBX3血清可特异识别细胞外源过表达的PBX3蛋白,同时可检测到细胞外源性PBX3蛋白的细胞内定位情况。结论获得效价和特异性良好的PBX3多克隆抗体。

结肠炎小鼠模型的病理机制研究

目的研究右旋葡聚糖硫酸钠(dextran sodium sulfate,DSS)诱导小鼠溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)模型引发的病理、免疫机制,以期为UC的治疗提供新的线索。方法将24只8周大的C57BL/6J清洁级子鼠分为DSS水溶液喂食1、3、5 d组以及无DSS水溶液对照组4组,每组6只。免疫组织化学检测小鼠结肠病理特征;应用实时定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)验证免疫因子在小鼠UC组织的表达状态。结果随着小鼠饮用DSS水溶液时间的增加,其体质量逐渐下降,结肠长度逐渐缩短,脾增大。小鼠肠黏膜组织HE染色结果显示,DSS水溶液喂食5 d组的小鼠肠黏膜有肠溃疡的症状,髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)染色可观察到中性粒细胞广泛浸润;此外,与对照组相比,炎性反应因子及炎性反应相关因子包括肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白介素-1α(interleukin-1α,IL-1α)、IL-1β、IL-6、趋化因子配体-1[chemokine(CX-C motif) ligand 1,CXCL-1]、CXCL-2和环氧化酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)表达水平显著增高。结论 DSS水溶液喂食5 d可形成UC模型,并伴随炎性反应因子、趋化因子大量浸润,提示UC的发生发展与炎性反应因子浸润密切相关,可能通过抑制其免疫因子的释放而控制UC疾病的进展。

Myosin Va RNAi慢病毒载体的构建及对肺癌PG细胞运动和迁移能力的影响

目的构建人非常规肌球蛋白myosinVa基因RNAi慢病毒载体,并探讨其对人肺巨细胞癌PG细胞运动和迁移能力的影响。方法针对已经筛选确定的myosinVa基因RNAi有效靶序列,合成靶序列及其阴性对照的寡聚DNA,并连接到pSuper载体获得中间实验质粒pSuper-shM5A及阴性对照pSuper-shCON;然后将H1promoter-shM5A/shCON表达框重组到慢病毒载体plenti4上,分别得到plenti4-H1-shM5A和shCON载体,并进行慢病毒包装。随后用病毒上清感染PG细胞,并筛选出zeocin抗性的稳定细胞系PG-shM5A和shCON。通过RT-PCR方法检测PG-shM5A和shCON细胞的myosinVamRNA表达水平;用创伤愈合和Boyden小室实验测定PG-shM5A和shCON细胞的运动和迁移能力。结果限制性内切酶酶切和测序证实,成功构建myosinVaRNAi慢病毒载体plenti4-H1-shM5A。慢病毒包装成功后,感染PG细胞并获得zeocin抗性的细胞;用RT-PCR方法证明,myosinVamRNA被抑制70%以上。创伤愈合和Boyden小室实验表明,感染携带myosinVaRNAi慢病毒的PG细胞运动和迁移能力显著下调。结论成功构建myosinVaRNAi慢病毒载体plenti4-H1-shM5A,它能有效抑制人肺巨细胞癌PG细胞的myosinVa表达并降低其运动和迁移能力,初步揭示了myosinVa与肿瘤细胞恶性行为的相关性。

复方中药注射液对小白鼠艾氏腹水癌细胞膜表面的(Na^(+)-K^(+))-ATP酶和微绒毛影响的电镜观察

本实验应用电镜细胞化学和扫描电镜技术,观察到小白鼠艾氏腹水癌细胞在复方中药注射液的连续作用下,膜表面(Na^(+)-K^(+))-ATP酶活性减弱,微绒毛减退等变化,同时观察到该复方中药注射液对癌细胞增殖的抑制作用,抑瘤率可达87%,癌细胞增殖和(Na^(+)-K^(+))-ATP酶活性及微绒毛的多少有平行关系。讨论了该复方中药抑制癌细胞增殖与膜表面(Na^(+)-K^(+))-ATP酶活性和微绒毛变化的关系。

用考马斯蓝R250(Coomassie Blue R250)显示人成纤维细胞内微丝的观察

用考马斯蓝显示人包皮成纤维细胞的微丝。使用微丝的特异性抑制剂细胞松弛素B,对微丝进行抑制处理及恢复实验,进一步肯定了考马斯蓝染色效果的可靠性。

微丝骨架蛋白分子重组与细胞转化

本文介绍正常细胞微丝骨架组装特点和与细胞贴壁及运动的关系;细胞转化后,应力纤维和粘着斑破坏,微丝骨架蛋白分子重组装,肌动蛋白小体形成等变化与转化细胞恶性行为的相关性。本文并提出今后有关本领域的研究方向。

人胃癌不同周期细胞膜表面ConA受体的分布与侧向运动

本文研究了人胃低分化粘液性腺癌细胞MGC 80-3不同周期时相中ConA受体的分布与侧向运动。MGc 80-3细胞经同步化培养,用F-ConA标记。被标记细胞中G_1、S和G_2期呈不连续的分布,但它们之间又存在显著的差异。M期呈较均匀的强荧光分布(与其它时相细胞比较)。荧光漂白恢复方法测定ConA受体复合物侧向运动表明:各个周期时相之间不仅运动方式不同,而且运动速率也有显著差异。M期与G_1期主要表现出扩散型运动;而S期与G_2期表现为流动型运动。G_1期的扩散系数大干M期的;S期的流动速率大于G_2期的。但可动分子百分比以G_2期最高。这些结果表明了ConA受体的动力学性质。它受到细胞周期的调节。

促癌变剂对淋巴细胞核仁rRNA基因转录的活化作用——rDNA原位杂交荧光显示法

用原位杂交荧光显示法观察了人淋巴细胞在促癌变剂黄芫花提取物(WCE)和12-0-十四烷巳豆醇-13乙酸酯(TPA)处理后,间期核仁rDNA的定位与数量改变,并与丝裂原植物血细胞凝集素(PHA)的效应作了比较,同时用银染色法观察了核仁。对照组淋巴细胞核仁小,原位杂交的rDNA为少数明亮荧光斑和分散的荧光点。经促癌变剂WCE和TPA处理后,银染色的核仁增大,银染颗粒增多,表明rDNA转录活化。原位杂交证明rDNA信号数目明显扩增,许多荧光小点断续相连形成网织状结构,与PHA刺激核仁转录活化的表现一致。对核仁内所含银染颗粒和rDNA荧光斑点数均值的统计学分析表明,WCE、TPA和PHA各加药组均明显多于对照组。3个加药组之间无明显差别。提示两种促癌变剂皆具有刺激核仁rDNA扩增和转录活化的效应。

人胃癌细胞不同增殖周期与HPD光敏损伤的关系

应用超微结构技术研究 HPD 加红光对人胃低分化粘液腺癌细胞损伤敏感部位与细胞周期时相的关系.HPD 光敏作用从细胞超微结构损伤中呈现出显著的周期特异性,M 期细胞以核部位损伤比胞质更为敏感。且损伤严重;G_1期细胞以质膜与胞质损伤明显;S 和 G_2期细胞以线粒体和其它细胞器的损伤最为严重,与 G_1期相似但质膜损伤很小.

3',5'-cAMP对不同瘤龄的艾氏腹水癌细胞内cAMP免疫荧光细胞化学反应及其磷酸二酯酶的细胞化学反应与癌细胞膜表面某些形态学变化的关系

本工作用外源性cAMP加氨茶碱对小鼠艾氏腹水癌细胞进行了多方面的研究,观察到外源性3′,5′-cAMP不仅对小鼠艾氏腹水癌细胞增殖有显著的抑制作用。在接种后第9天,看到癌细胞增殖受到抑制的同时,大多数癌细胞胞质内的cAMP免疫荧光细胞化学反应增强,癌细胞内3′,5′-cAMP磷酸二酯酶(PDE)活性受到抑制,此外,还观察到某些癌细胞表面膜上微绒毛消失或变短以及对植物凝集素的凝集反应减弱等现象,这些癌细胞的逆转表现的变化均与不同瘤龄的癌细胞有关,如经外源性cAMP处理后,cAMP-PDE活性降低出现的最早,均在接种后5~7天时最为明显,cAMP免疫荧光细胞化学反应是在接种后第9天最为显著,癌细胞表面膜上的微绒毛消失和变短的细胞比数明显增多,对植物凝集素的凝集反应减轻都是在接种后7~9天时最为显著,而cAMP对小鼠艾氏腹水癌细胞的增殖抑制作用是在接种后第9~11天最为明显。根据上述实验结果,本文讨论了外源性cAMP加氨茶碱对腹水癌细胞的抑制作用和癌细胞内cAMP荧光反应,3′,5′-cAMP-PDE活性以及癌细胞表面膜上微绒毛形态学变化的因果关系。

EAC细胞在3＇5＇－cAMP诱导下PKA－RⅡ移位入核与癌基因表达的动力学变化

Ｅｈｒｌｉｃｈ细胞在ｃＡＭＰ加茶碱的诱导下，于接种后５－７天，伴随着胞质内ｃＡＭＰ蛋白结合率上升的同时，依赖于ｃＡＭＰ的蛋白激酶Ⅱ型酶调节亚基（ＰＫＡ－ＲⅡ）从胞质向核移位，其表达强度在胞质和核内持续升高，此时癌基ｃ－ｍｙｃ，ｃ－ｆｏｓ，ｃ－Ｈ－ｒａｓ，ｃ－ｓｉｓ表达抑制。ｃＡＭＰ蛋白结合率与ＰＫＡ－ＲⅡ的移位入核呈显著的正相关，二者与癌基因表达抑制是显著的负相关，它们均从第７天最为显著。在癌龄晚期（按种后９－１１天），当胞质内ｃＡＭＰ蛋白结合率下降（与对照组比较）时，ＰＫＡ－ＲⅡ则停止移位入核，癌基因又重新表达，如果用ｃＡＭＰ抑制剂人为阻断接种后第７天的癌细胞内ＰＫＡ信号通路时，ＰＫＡ－ＲＨ则停止移位入核，而癌基因仍呈强烈表达。对上述各结果之间的关系进行了分析与讨论。

骨骼肌肌丝分化与横纹肌肉瘤分化异常的研究

本工作观察了鸡胚胸肌原代培养物内完成末次分裂的有丝分裂后肌母细胞在初生0时—22小时内形态分化与肌专一蛋白表达的时、空间特征。肌母细胞的肌分化程序是(1)退出细胞周期,(2)开始合成和集累结蛋白与肌丝蛋白,(3)细胞伸长,肌丝肌节的装配,(4)细胞融合形成多核肌管。横纹肌肉瘤的细胞周期与肌终末分化关系异常,肌丝分化阻断。少数瘤细胞形成正常肌丝肌节,表明瘤细胞内仍存在正常肌分化所需的全部遗传信息。肌分化程序的某些特定基因功能性表达异常可能是增殖与分化紊乱的主要原因。

复方中药和3′,5′环腺苷酸(cAMP)对小鼠艾氏腹水癌细胞的抑制效果与癌细胞内cAMP含量及cAMP-PDE活性变化关系

本工作用复方白蛇酒及外源性cAMP对小鼠艾氏腹水癌进行比较实验,通过实验观察到该复方制剂和外源性3’,5’-cAMP对小鼠艾氏腹水癌细胞的增殖均有显著的抑制作用,癌细胞增殖受到抑制的同时,癌细胞内3’,5’-cAMP含量显著提高;控制cAMP水平的3’,5’-cAMP磷酸二酯酶(PDE)活性受到抑制。该复方之所以能提高癌细胞内cAMP水平可能是由于细胞内3’,5’-cAMP-PDE.活性受到抑制所致。本工作进一步将该复方组分的两部份(六味中草药和蟾蜍酒)与原复方白蛇洒分别进行实验比较,观察到前两组癌细胞内3’,5’-cAMP水平和3’,5’-cAMP-PDE的活性均未看到显著变化,本工作可为中医临床用药和疗效机理提供一定的理论依据。

MEF2与肌肉发生

MEF2属于MADS（MCM1,agamous,deficiens,serum response factor）框转录因子家族,在肌肉发生过程中起着重要的调节作用。本文综述了肌肉发生过程中MEF2,基因的表达调控、MEF2蛋白活性调节及其激活靶基因表达等,着重阐述了MEF2在钙调素一钙调磷酸酶与TGF-β-Smad通路中的作用,并分析了MEF2成为肌肉发生中承接信号分子与结构蛋白之间桥梁的原因。