目的 基于分泌卷曲相关蛋白2(secreted frizzled-related protein 2,SFRP2)基因,评价荧光定量法(Methy Light)、微滴数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)、核酸质谱、靶向亚硫酸氢盐二代测序4种甲基化检测方法。方法 对4种甲基化检测方...目的 基于分泌卷曲相关蛋白2(secreted frizzled-related protein 2,SFRP2)基因,评价荧光定量法(Methy Light)、微滴数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)、核酸质谱、靶向亚硫酸氢盐二代测序4种甲基化检测方法。方法 对4种甲基化检测方法的检测限(limit of detection, LOD)、定量限(limit of quantitation, LOQ)及稳定性方面进行比较,其中稳定性用变异系数(coefficient of variation,CV)来评估。结果 SFRP2基因在Methy Light、ddPCR、核酸质谱和靶向亚硫酸氢盐二代测序中的LOD分别为1.2500ng/孔、0.0625ng/孔、0.0625ng/孔、1.2500ng/孔,在LOD方面,ddPCR和核酸质谱的表现较好;SFRP2基因在MethyLight、ddPCR、核酸质谱和靶向亚硫酸氢盐二代测序中的LOQ分别为0.800%、0.032%、4.000%、0.032%,在LOQ方面,ddPCR和靶向亚硫酸氢盐二代测序的表现较好;SFRP2基因在MethyLight、ddPCR、核酸质谱和靶向亚硫酸氢盐二代测序中的变异系数分别为2.72%、0.68%、0.73%、0.15%,在稳定性方面,靶向亚硫酸氢盐二代测序的表现最好。结论 ddPCR的甲基化检测在检测限、定量限稳定性和经济性方面具有优越性,能够稳定地检测出肿瘤细胞的痕量游离DNA,在液态活检中具有广泛应用前景。展开更多
目的基于尿液中的谷胱甘肽硫转移酶P1(glutathione S-transferase pi-1,GSTP1)基因,对微滴式数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)检测循环DNA甲基化的方法学进行性能评价。方法根据甲基化检测试剂盒相关IVD产品的注册指南,主要从引物探...目的基于尿液中的谷胱甘肽硫转移酶P1(glutathione S-transferase pi-1,GSTP1)基因,对微滴式数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)检测循环DNA甲基化的方法学进行性能评价。方法根据甲基化检测试剂盒相关IVD产品的注册指南,主要从引物探针特异性、灵敏度、批内精密度、批间精密度、准确度5个方面对数字PCR检测尿液循环DNA甲基化进行性能评价。结果GSTP1基因仅在前列腺癌样本中生成明显阳性微滴,在胃癌、肝癌、肾细胞癌、肺癌、膀胱癌、尿道癌、结直肠癌和胰腺癌中不生成阳性微滴,引物探针特异性良好;GSTP1基因的检测限为0.1ng/孔,当DNA输入量大于等于0.1ng/孔时,DNA甲基化情况都可以被检测到,灵敏度较好;批内精密度变异系数均小于6.25%,批间精密度变异系数均小于8.33%,符合CLSI参考文件的标准,表示精密度良好;通过比较数字PCR与荧光定量PCR(Methylight)检测前列腺癌尿液样本GSTP1甲基化情况,相关系数为0.9949,表明两种方法相关性较好,证明数字PCR准确度良好。结论数字PCR检测尿液循环GSTP1基因甲基化的方法在特异性、灵敏度、精密度、准确度均表现良好,符合临床实验室标准,是一种检测尿液循环DNA甲基化的可靠方法。展开更多
文摘目的 基于分泌卷曲相关蛋白2(secreted frizzled-related protein 2,SFRP2)基因,评价荧光定量法(Methy Light)、微滴数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)、核酸质谱、靶向亚硫酸氢盐二代测序4种甲基化检测方法。方法 对4种甲基化检测方法的检测限(limit of detection, LOD)、定量限(limit of quantitation, LOQ)及稳定性方面进行比较,其中稳定性用变异系数(coefficient of variation,CV)来评估。结果 SFRP2基因在Methy Light、ddPCR、核酸质谱和靶向亚硫酸氢盐二代测序中的LOD分别为1.2500ng/孔、0.0625ng/孔、0.0625ng/孔、1.2500ng/孔,在LOD方面,ddPCR和核酸质谱的表现较好;SFRP2基因在MethyLight、ddPCR、核酸质谱和靶向亚硫酸氢盐二代测序中的LOQ分别为0.800%、0.032%、4.000%、0.032%,在LOQ方面,ddPCR和靶向亚硫酸氢盐二代测序的表现较好;SFRP2基因在MethyLight、ddPCR、核酸质谱和靶向亚硫酸氢盐二代测序中的变异系数分别为2.72%、0.68%、0.73%、0.15%,在稳定性方面,靶向亚硫酸氢盐二代测序的表现最好。结论 ddPCR的甲基化检测在检测限、定量限稳定性和经济性方面具有优越性,能够稳定地检测出肿瘤细胞的痕量游离DNA,在液态活检中具有广泛应用前景。
文摘目的基于尿液中的谷胱甘肽硫转移酶P1(glutathione S-transferase pi-1,GSTP1)基因,对微滴式数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)检测循环DNA甲基化的方法学进行性能评价。方法根据甲基化检测试剂盒相关IVD产品的注册指南,主要从引物探针特异性、灵敏度、批内精密度、批间精密度、准确度5个方面对数字PCR检测尿液循环DNA甲基化进行性能评价。结果GSTP1基因仅在前列腺癌样本中生成明显阳性微滴,在胃癌、肝癌、肾细胞癌、肺癌、膀胱癌、尿道癌、结直肠癌和胰腺癌中不生成阳性微滴,引物探针特异性良好;GSTP1基因的检测限为0.1ng/孔,当DNA输入量大于等于0.1ng/孔时,DNA甲基化情况都可以被检测到,灵敏度较好;批内精密度变异系数均小于6.25%,批间精密度变异系数均小于8.33%,符合CLSI参考文件的标准,表示精密度良好;通过比较数字PCR与荧光定量PCR(Methylight)检测前列腺癌尿液样本GSTP1甲基化情况,相关系数为0.9949,表明两种方法相关性较好,证明数字PCR准确度良好。结论数字PCR检测尿液循环GSTP1基因甲基化的方法在特异性、灵敏度、精密度、准确度均表现良好,符合临床实验室标准,是一种检测尿液循环DNA甲基化的可靠方法。
