时间分辨荧光免疫法与电化学发光法检测结直肠肿瘤标志CEA的比较

目的:对时间分辨荧光免疫法(TRFIA)与电化学发光免疫法 (ECLIA)检测血清癌胚抗原CEA作比较分析,了解两种方法的特点及这两种方法对结直肠癌检出率的影响．方法:分别采用TRFIA法及ECLIA法检测正常人、结直肠癌、非结直肠癌患者组共90例,每组各30例临床送检标本血清CEA含量,应用SPSS(Chicago,USA)软件进行统计学比较和分析．结果:结直肠癌组CEA值(TRFIA法:44．12±95．27 μg／L, ECLIA法:35．96±71．83 μg／L)明显高于正常组(TRFIA 法:1．04±0．55 μg／L,ECLIA法:0．71±0．48 μg／L)(P<0．01)． TRFIA和ECLIA的灵敏度分别为60．0％、66．7％,特异性 98.3％、100％,准确性85．6％、88．9％,阳性预测值94．7％、 95．2％及阴性预测值83．1％、85．7％．两种方法检测的灵敏度、特异性、准确性、阳性预测值及阴性预测值略有不同,后者优于前者,但两者无显著差异(P>0．05),相关性好(r= 0．973 8)．结论:TRFIA法和ECLIA法具有良好的相关性,并且具有灵敏度高和稳定性好等优点,可应用于临床血清CEA检测．

细胞因子Midkine融合蛋白的表达及其单克隆抗体的制备与应用

目的:克隆细胞因子midkine(MK)基因,表达其融合蛋白,制备抗MK单克隆抗体(mAb)并检测MK在肿瘤细胞中的表达。方法:利用MK基因的特异性引物,通过RT-PCR从人肾癌组织mRNA中扩增人MKcDNA分子。将其定向克隆于原核表达载体中,在大肠杆菌中表达MS2-MK融合蛋白。以纯化的融合蛋白免疫BALB/c小鼠,用传统的杂交瘤技术,进行细胞融合、筛选、克隆化并制备mAb腹水。用ELISA法分析其Ig亚类,用免疫细胞化学染色法检测MK在肿瘤细胞中的表达。结果:成功地克隆出MK基因并表达了MS2-MK融合蛋白。通过免疫和筛选,获得2株分泌小鼠抗人MKmAb的杂交瘤细胞,其分泌的mAb的Ig亚类分别为IgG1和IgG2a。免疫细胞化学染色显示,2株mAb与人胃癌细胞株MGC803和胃癌组织呈强阳性反应。结论:在原核细胞中获得MS2-MK融合蛋白的表达,并制备出抗MK的mAb,为研究MK的生物学活性提供了条件。

肝癌细胞BEL7402中神经元特异性烯醇化酶的表达

目的:分别从转录水平、蛋白水平及细胞水平检测人神经元特异性烯醇化酶(NSE)在肝癌细胞BEL7402中的表达情况.方法:利用NSE特异引物,通过逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)从人肝癌细胞BEL7402中扩增人NSE基因的转录产物,采用免疫印迹(Westernblot)、免疫细胞化学(ICC)染色技术检测NSE在肝癌细胞中的表达.结果:通过RT-PCR方法可以从BEL7402中扩增1305bp的NSE产物;Westernblot方法证实BEL7402细胞可以表达Mr50000的NSE蛋白;免疫细胞化学染色显示BEL7402与抗NSE单抗呈阳性反应,这说明从转录水平、蛋白水平及细胞水平均检测到了NSE在肝癌细胞BEL7402中的表达.结论:NSE可在肝癌细胞BEL7402转录和表达.

人神经元特异性烯醇化酶基因克隆及单克隆抗体的制备与鉴定

目的研究建立克隆人神经元特异性烯醇化酶(NSE)基因制备鼠抗人NSE单克隆抗体方法。方法用NSE特异引物,通过逆转录多聚酶链式反应从人肺癌细胞株A549中扩增NSE基因,构建重组质粒pGEMTNSE,并测序鉴定NSE基因序列。再将NSE基因定向克隆于原核高效表达载体pMS31b,当表达MS2NSE融合蛋白后,免疫BALB/C小鼠。并用常规杂交瘤技术,制备鼠抗人NSE单克隆抗体(NSEMcAb)。最后,采用免疫细胞化学(ICC)技术检测NSE在肿瘤细胞株中的表达。结果克隆岀全长1305bp的NSE基因,其表达的MS2NSE融合蛋白为57000,表达量142mg/L。获得2株能稳定分泌抗NSE单克隆抗体的杂交瘤细胞株,经检测其分泌抗体的亚型分别为IgG1和IgG2a。ICC检测证明所得NSEMcAb能检测到肿瘤细胞中NSE的表达。结论成功克隆了NSE基因,并获得鼠抗人NSEMcAb,为深入研究NSE基因的表达提供了有力的工具。

人Survivin基因克隆和单克隆抗体的研制及在肝癌中的表达

目的对人Survivin基因进行克隆,制备和鉴定针对人Survivin的单克隆抗体,检测Survivin在肝癌中的表达。方法利用RTPCR方法从人乳腺癌细胞MCF7扩增克隆Survivin基因,构建可表达Survivin蛋白的原核表达载体,在大肠杆菌中表达MSSurvivin融合蛋白。以纯化的融合蛋白免疫BALB/C小鼠,取其脾细胞,用传统杂交瘤技术与小鼠骨髓瘤细胞融合及次黄嘌呤、氨基蝶呤与胸苷选择性培养。单克隆杂交瘤上清经ELISA双筛后,进行亚类和Westernblot分析。免疫化学方法检测Survivin在肝癌中的表达情况。结果克隆了429bp的Survivin全长基因。经ELISA双筛,获得了4株能稳定分泌针对Survivin的单克隆抗体的杂交瘤细胞株,其分泌抗体亚类均为IgG1。Westernblot结果显示,抗Survivin单抗可与MSSurvivin融合蛋白呈特异性结合。免疫细胞化学显示,该单抗与人肝癌HepG2细胞株呈阳性反应,并且可与肝癌组织结合,呈强阳性反应。结论以分子生物学技术克隆了凋亡抑制因子人Survivin基因,通过原核表达产物制备并纯化了针对Survivin的单克隆抗体,Survivin可在肝癌细胞和肝癌组织中表达,为深入研究Survivin的功能和临床检测肿瘤组织及体液中的Survivin奠定了可靠基础。