^(64)Cu-NOTA-Herceptin的设计、活性测定及肿瘤靶向分子显像研究

利用双功能螯合剂2-[(4-异硫氰基苯基)甲基]-1,4,7-三氮杂环九烷-1,4,7-三乙酸(NCS-Bz-NOTA)对Herceptin单抗表面的氨基进行修饰获得了NOTA-Herceptin,通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)对该偶联物进行了表征.利用酶联免疫吸附测定了偶联前后Herceptin抗体效价的改变.利用新型正电子核素^(64)Cu标记,获得可用于肿瘤放射靶向精准诊疗的^(64)Cu-NOTA-Herceptin探针,其标记率为90%,放化纯度>98%,比活度185 MBq/nmol.分别进行了该探针在HER2过表达胃癌细胞NCI-N87及HER2低表达胃癌细胞BGC823等肿瘤细胞中的摄取实验,测定了该探针的肿瘤特异性.建立了荷人胃癌BGC823裸鼠模型,通过微型正电子断层显像(Micro-PET)设备观察了探针在模型动物体内的代谢情况:在静脉注射7.4 MBq^(64)Cu-NOTA-Herceptin探针后,分别于4和60 h进行正电子断层显像(PET)的显像,观察到其在肿瘤部位的摄取有所富集,且随着代谢时间的延长,肝脏部位摄取得到明显降低.研究结果表明,^(64)Cu-NOTAHerceptin探针有望应用于肿瘤放射性靶向诊疗.

HER-2/neu肿瘤疫苗的研究进展

原癌基因HER-2/neu在多种恶性肿瘤中有扩增及过表达,近30%的原发性乳腺癌患者有HER-2/neu过表达。针对HER-2靶点的特异性人源化抗体曲妥株单抗(trastuzumab;又名赫赛汀,Herceptin)在上世纪90年代已用于临床治疗。目前针对HER-2的肽疫苗、蛋白疫苗、细胞疫苗、DC相关疫苗、以及DNA疫苗等的研究,均已取得一定进展,如小肽E75(p369-399)与GM-CSF联合应用,在HLA-A2(+)/A3(+)乳腺癌患者的Ⅱ期临床试验中显示出一定疗效;针对编码HER-2的DNA疫苗已经进入临床试验阶段,这些疫苗均有可能成为乳腺癌治疗的又一个重要手段。但这些疫苗距临床实际使用尚有一定的距离,有许多问题有待解决和需要进一步的临床验证。

支原体感染与肿瘤

支原体是广泛存在于自然界的条件致病微生物,可能是唯一可以与真核生物共生,并可与哺乳动物细胞长期相互作用的原核生物。多种不同的肿瘤组织中可检测到支原体的存在,某些支原体的持续感染可导致哺乳动物细胞的转化、上调癌基因的表达并引起肿瘤细胞生物学行为的改变,提示支原体感染与肿瘤的发生有潜在的相关性。

中枢神经系统肿瘤的雌孕激素受体

本文报告了42例中枢神经系统肿瘤的ER、PR状况。其中脑膜瘤10例,胶质瘤15例,神经纤维瘤8例,其他肿瘤9例。42例中,ER阳性者仅3例,占7.1％。PR阳性率:脑膜瘤组为60.0％,胶质瘤组为13.3％,神经纤维瘤组为37.5％,其他肿瘤组为11.1％。脑膜瘤PR含量明显高于胶质瘤、神经纤维瘤以及其他肿瘤。在脑膜瘤组,PR含量明显高于ER含量,提示脑膜瘤可能是孕激素的靶组织。神经纤维瘤组PR阳性率仅次于脑膜瘤,其PR含量也高于ER含量,与脑膜瘤类似。

噬菌体随机肽库中乳腺癌肿瘤标志物的筛选

目的:利用噬菌体随机12肽库对乳腺癌患者血清进行差异性筛选,以获得乳腺癌特异性的肿瘤标志物。方法:以混合乳腺癌患者血清IgG作为筛选分子,对噬菌体随机12肽库进行亲和筛选;3轮淘选后,应用常规ELISA鉴定噬菌体单克隆;阳性克隆经测序后,选择与乳腺癌血清结合活性最高的多个噬菌体的共有小肽序列来人工合成其相应的寡核苷酸序列,并将其克隆至原核表达载体pGEX-4T-1中,经诱导表达及纯化GST-小肽融合蛋白后,应用常规ELISA检测20例乳腺癌患者和20例正常人与GST-小肽的结合反应。结果:3轮筛选没有明显的富集现象,但获得38个可与乳腺癌患者血清反应,而不与正常人血清反应的阳性克隆。经扩大乳腺癌患者血清样本例数进一步检测后对8个结合活性始终较高的阳性克隆进行测序发现部分克隆序列相同;将其中结合活性最高的小肽序列P15与GST蛋白进行融合表达,并分别检测其与20例乳腺癌患者和正常人血清的结合反应,结果提示患者血清与GST-P15的反应明显高于正常人,差异有统计学意义(P<0.01)。结论:筛选到的小肽P15可以特异结合乳腺癌患者血清中的抗体。该小肽为进一步寻找乳腺癌患者体内相应的肿瘤抗原奠定了一定的基础。

肿瘤及胚胎特异表达蛋白CEP65的真核细胞表达及其细胞定位

背景与目的:既往研究表明,肿瘤相关抗原CEP65(cancer and em bryoexpression protein65)仅表达于肿瘤和胚胎组织,本研究拟揭示CEP65在细胞中的分布,为进一步阐明CEP65在肿瘤发生、发展中的功能奠定基础。方法:构建肿瘤及胚胎特异表达基因Cep65与GST融合表达的真核表达质粒,通过DEAE-Dextran方法转染COS7细胞,分离细胞的胞浆蛋白和核蛋白,W estern blot检测CEP65在细胞中的分布情况。构建Cep65与红色荧光蛋白基因融合表达的真核表达质粒,转染细胞后,利用荧光显微镜观察CEP65在细胞中的分布。结果:通过细胞组分生化分析分离细胞胞浆蛋白和核蛋白,W estern blot检测结果表明,表达的CEP65分布在细胞浆和细胞核中。荧光蛋白定位进一步分析发现,转染单纯荧光蛋白表达质粒的细胞,其荧光在细胞内呈弥散性分布,而转染CEP65与荧光蛋白基因融合表达质粒的细胞,在细胞质及细胞核内形成聚集的荧光颗粒。结论:CEP65可在COS7细胞中高效表达,其表达产物存在于细胞质和细胞核内;CEP65可能是一种核相关蛋白。

胃癌和癌旁组织癌基因c—Ha—ras第12位密码点突变测定的研究

本文利用PCR—RFLP法,测定了18例胃癌和18例癌旁组织的癌基因cHa-ras第12位密码子点突变。结果表明,胃癌点突变率为39％,癌旁组织点突变率为11％,其中癌旁组织所能测出的点突变在同一标本来源的胃癌组织中也可测出。因此,对于癌瘤的诊断,我们应尽早地创立一种更灵敏、更准确的能检测出癌早期细胞中基因改变的分子生物学的诊断方法。

P_4噬菌体——一种卫星噬菌体的特性及其DNA的研究

本实验观察了P4噬菌体在大肠杆菌C117中的增殖过程。该噬菌体在60℃几乎完全被灭活,对紫外线有抗性,对乙醇和EDTA溶液敏感。用电镜和琼脂糖凝胶电泳对其DNA进行分析提示,P4噬菌体中除含一般的双链开环和线性DNA外,在未完全成熟时它的头部衣壳中还有一种复杂的不均一打结DNA,这种特殊构型DNA的发现将为DNA拓扑异构酶Ⅱ的鉴定及酶活力测定奠定基础。

个体化肿瘤特异TCR的筛选策略

基因修饰T细胞疗法在肿瘤治疗领域取得突破性进展,主要包括嵌合抗原受体基因修饰T(chimeric antigen receptor engineered T,CAR-T)细胞和T细胞受体基因修饰T(T-cell receptor modified T,TCR-T)细胞。虽然CAR-T细胞疗法在血液系统肿瘤治疗领域呈现良好的临床治疗效果,但CAR-T细胞仅能识别肿瘤细胞膜抗原(占细胞全部抗原的比例约10%),而TCR-T细胞可以识别人白细胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)提呈的细胞内抗原,因此TCR-T细胞可以识别更多种类的肿瘤抗原,进而实现对CAR-T细胞的合理补充。由于TCR-T细胞需要同时识别细胞内抗原和对应的HLA,而不同患者的HLA分型和表达的肿瘤抗原都可能存在巨大差异,因此有必要为每个/每类肿瘤患者定制个体化的TCR-T细胞,其中的关键为筛选特异识别肿瘤抗原的TCR。当前主要有筛选靶向“已知”肿瘤抗原TCR和筛选靶向“未知”肿瘤抗原TCR的两种策略,但其各有适用性,应针对每个患者制定适合的筛选方法,以制备多种肿瘤特异性TCR-T细胞,从而实现个体化TCR-T细胞的肿瘤治疗。

抗人p185^(erbB2)人-鼠嵌合抗体真核表达载体的构建表达及活性测定

目的 :HER2 /neu过度表达见于多种恶性肿瘤。作为肿瘤抗原 ,p185 erbB2 是一个理想的肿瘤治疗靶点。本实验在既往工作基础上 ,构建嵌合型抗p185 erbB2 单克隆抗体 (单抗 )的真核表达载体 ,并在CHO dhfr-细胞中表达 ,从而降低鼠源性抗体的免疫原性 ,为进一步的应用研究奠定基础。方法 :RT -PCR扩增p185 erbB2 单抗 1 2的轻、重链可变区基因 ,插入嵌合抗体真核表达载体pWSD2中 ,脂质体转染CHO dhfr-细胞。经RT -PCR、间接ELISA、Westernblot检测人 -鼠嵌合抗体的表达水平 ,用ELISA、免疫沉淀方法对嵌合抗体的亲和力和特异性进行初步鉴定。此外 ,采用MTT比色法检测嵌合抗体对高表达p185 erbB2 的乳腺癌细胞系SKBR3的生长抑制作用。结果 :用RT -PCR、间接ELISA、Westernblot方法证明人 -鼠嵌合抗体在CHO dhfr-细胞中表达 ;ELISA检测提示嵌合抗体与高表达p185 erbB2的细胞反应阳性 ,与低表达p185 erbB2 的细胞反应阴性 ;免疫沉淀结果表明嵌合抗体可与p185 erbB2 分子特异性结合 ;MTT比色法检测表明嵌合抗体对过表达p185 erbB2 的乳腺癌细胞SKBR3的生长有抑制作用。结论 :CHO dhfr-细胞表达的人 -鼠嵌合抗体可与p185 erbB2 特异性结合 ,并可抑制高表达p185 erbB2 的肿瘤细胞生长 ,表明抗人p185 erbB2 人

乳腺癌之c-erbB-2高度扩增、表达与雌孕激素受体的相关性

用自制抗ｐ１８５ＭｃＡｂ－５Ｅ１２和进口抗ｐ１８５ＭｃＡｂ（ｃ－ｎｅｕＡｂ－３）以免疫组化法对５７例原发性乳腺癌组织的ｐ１８５表达情况进行对比研究，并以ＤＣＣ法测定其雌孕激素受体水平，对其中３４例乳腺癌组织提取ＤＮＡ进行ｃ－ｅｒｂＢ－２的Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ分析。观察ｃ－ｅｒｂＢ－２癌基因扩增与蛋白表达水平及其与雌孕激素受体水平之间的相关性。结果显示免疫组化法测定ｐ１８５蛋白表达与Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ测定基因扩增的结果个例对应的阴阳性符合率为９４．１％（３２／３４），５Ｅ１２和进口ｃ－ｎｅｕＡｂ－３的个例对应阴阳性符合率为９６．５％（５５／５７），另外，ｐ１８５表达水平雌孕激素受体呈负相关。结果表明ｃ－ｅｒｂＢ－２蛋白产物ｐ１８５表达水平基本可以反映基因ｃ－ｅｒｂＢ－２扩增水平的变化；同时，也说明５Ｅ１２有良好的特异性和灵敏性，已达进口ＭｃＡｂ水平。

应用小肽融合蛋白免疫诱导抗HER-2体液免疫反应

目的应用HER-2 B细胞表位模拟小肽Mut与Hsc70的融合蛋白诱导抗小肽和抗HER-2的体液免疫反应。方法将Hsc70和Mut小肽序列定向插入pQE40载体中,构建pQE40-Hsc70-Mut原核表达质粒,并诱导表达、纯化融合蛋白Hsc70-Mut。常规免疫Balb/c小鼠,应用ELISA、Western blot检测小鼠血清中抗小肽Mut和抗HER-2的体液免疫反应。结果成功构建了pQE40-Hsc70-Mut原核表达质粒,Hsc70-Mut融合蛋白在大肠杆菌SG13009能够实现可溶性表达,应用Ni-NTA纯化可得到纯度>90%的融合蛋白;Hsc70-Mut免疫小鼠可产生抗Mut小肽的免疫反应,部分小鼠同时可产生抗HER-2的体液免疫反应。结论 Hsc70-Mut融合蛋白免疫小鼠可产生抗小肽和抗HER-2的体液免疫反应,为HER-2疫苗的研制奠定了一定基础,同时应用小肽融合蛋白免疫也为小肽免疫提供了一种新的免疫策略。

组织蛋白酶D表达对乳腺癌预后的意义

用免疫组化法检57例乳腺癌患者的Cath－D在乳腺癌组织中间质细胞和癌细胞的表达情况。结果表明：间质细胞Cath—D的表达强度高于癌细胞（P＜0.01）；Cath—D阳性表达与乳腺癌的淋巴结转移呈正相关（P＜0．005）与五年生存期呈负相关（P＜O．0O5）；在无淋巴结和小于4个转移的病例中，间质Cath—D阳性表达与五年生存期呈负相关（P＜0．005），而癌细胞的阳性与淋巴结转移情况和五年生存期的关系无统计学意义。本研究提示乳腺癌间质Cath—D表达能作为预测乳腺癌预后因素之一。对选择高危人群进行针对性治疗有意义。

c－Ha－ras反义DNA及其衍生物对转化细胞恶性表型的逆转

应用突变ｃ－Ｈａ－ｒａｓ质粒ＤＮＡ转化小鼠Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２纤维细胞，发现细胞获得恶性表型。本文合成了反义ＤＮＡ（ｏｌｉｇｏ），它与ｃ－Ｈａ－ｒａｓ基因前４个密码子及其上游正链序列互补；并发现ｏｌｉｇｏ可有效地抑制恶性转化细胞内ｃ－Ｈａ－ｒａｓ基因表达、细胞在软琼脂中集落形成以及细胞在裸鼠体内的致瘤作用。补骨脂素修饰ｏｌｉｇｏ后，其生物学活性增强。

用酶解电泳图谱分析C—Ha—ras癌基因第12位密码子点突变

本实验以含正常细胞原癌基因c—Ha—ras 6.6Kb/Bam HI片段的重组质粒(简称J841)DNA和含人胃癌中克隆出的癌基因Ha—ras 6.6Kb/Bam HI片段的重组质粒(简称PGC6.6)DNA为材料,用限制性内切酶Nae I完全酶解,经1.2％琼脂糖凝胶电泳,发现两者的图谱有明显的差异。J841有0.86Kb和0.41Kb两条特征片段,而PGC6.6只有一条1.27Kb的特征片段。用放射性探针进行分子杂交,也显示出同样的结果。分析它们的DNA序列可知,PGC6.6第12密码子第2编码核苷酸由G突变为T,破坏了Nae I在此的切割位点,从而才出现这条1.27Kb的片段。本实验为c—Ha—ras癌基因第12密码子点突变的测定新方法。

以寡聚核苷酸为探针对癌基因Ha-ras点突变的测定

基因中一个核苷酸的改变(点突变)是原癌基因活化的途径之一。核苷酸序列分析表明,我们从胃癌细胞系中克隆出的癌基因Ha-ras,就是由于其编码区第35位核苷酸从鸟嘌呤(G)变为胸腺嘧啶(T)而被激活的。测定基因的点突变除了序列分析方法之外,还有比较简单、经济的寡聚核苷酸探针分子杂交等方法。

应用胃癌石蜡切片组织进行癌基因c-Ha-ras第12位密码点突变测定

本文初步建立了以胃癌石蜡切片组织为材料,应用PCR—RFLP法对癌基因c-Ha-ras第12位密码点突变进行测定的技术,这一技术方法的建立,对于肿瘤研究方面,在进一步扩大基础理论研究和临床的联系上有一定的意义。

从石蜡包埋和甲醛浸泡组织中提取DNA进行PCR扩增

对石蜡色埋组织用二甲苯或水浴法脱石蜡,乙醇进行梯度水化,溶液A裂解细胞,对经抽提、纯化后的DNA进行PCR扩增,获得了较满意的效果。同时对石蜡包埋组织与甲醛浸泡组织中的DNA受损程度进行了比较,此工作为能使肿瘤等症病将在基因水平上进行回顾性分析提供了一个良好开端.

P37腺病毒表达载体的构建及对乳癌细胞的促迁移作用

胃癌组织中存在着较高的猪鼻支原体感染率,而P37是猪鼻支原体的主要免疫原.以往研究表明,P37能抑制肿瘤细胞的黏附,促进肿瘤细胞浸润和转移.为了更好地研究P37在肿瘤发生和转移中的功能,通过基因克隆的方法,利用Ad-easy体系,在细菌BJ5183中同源重组后,转染293细胞,成功包装出重组P37腺病毒.它能有效感染乳腺癌细胞BICR.通过RT-PCR和蛋白质印迹检测表明,感染重组P37腺病毒后的BICR细胞能大量表达并分泌P37蛋白.运用该腺病毒体系进行细胞迁移实验表明,P37能显著增强BICR细胞的体外迁移能力.

癌基因fos的结构、活性及调控

本文介绍了癌基因fos的结构、活性、产物和诱导因素,并对调控机制进行了详细讨论.