生物化学与分子生物学系列实验课程优质资源的建设与教学实践

紧跟国家教育教学体系的建设与发展,我们于2015年探索课程体系改革,设计了“生物化学与分子生物学系列实验课程优质资源建设方案”,包括实验课程体系的设计,MOOC、SPOC、虚拟仿真实验教学项目、文献阅读资源、立体化教材、实验教学模式等的建设,构建课程优质资源和建设“金课”以系统培养和个性化提升学生的科研思维及创新能力,推进实验教学模式和方法改革。经过多年的实践,取得了良好的教学效果和示范效果,为其他高校课程改革提供了参考。

rcan1-1l基因的克隆和表达

从小鼠脑组织中通过总mRNA的提取、RT-PCR方法,利用pEASY-T1载体克隆出了鼠源rcan1-1l基因,并构建出了重组有rcan1-1l基因的PET21a原核表达质粒,进行了表达条件的初步摸索,这为今后研究rcan1-1l基因以及蛋白的结构与功能打下了前期实验基础.

钙调神经磷酸酶调节因子RCANs的研究进展

钙调神经磷酸酶(calcineurin,CN)作为机体中的一种丝/苏氨酸磷酸酶,在关键的生物学过程中发挥着重要作用.RCANs(regulators of calcineurin)是CN的一类内源调节因子,其家族成员在细胞中能够通过与CN在结构上的相互结合,起到调节CN活性的作用.而近来研究发现,该调节因子还可参与到CN-NFAT信号通路中发挥功能,从而与CN依赖的生理和病理过程的调控密切相关.因此,有必要对RCAN基因、RCANs蛋白与CN的相互作用以及该家族成员在病理条件下的重要功能作一个较为全面的综述,这些基础研究工作的进展将有助于为寻找新的疾病治疗方法和药物开辟新的途径.

金属离子对异柠檬酸脱氢酶激酶/磷酸酶（AceK）活性的影响

AceK是具有激酶与磷酸酶活性的双功能酶.本文研究了金属离子Mg2+、Fe2+、Ni2+、Zn2+对AceK激酶活性及磷酸酶活性的影响.实验表明Mg2+是AceK激酶与磷酸酶激活剂,对激酶最佳激活浓度为2mmol·L-1,磷酸酶为5mmol·L-1.但Fe2+、Ni2+、Zn2+单独存在时,对AceK激酶、磷酸酶活性均没有明显作用,反而能较强地抑制Mg2+激活的AceK酶活性,对激酶抑制作用由强到弱为Zn2+、Ni2+、Fe2+,对磷酸酶抑制作用由强到弱为Ni2+、Fe2+、Zn2+.研究内容和结果为进一步研究AceK催化机制和结构功能打下了一定的基础.

一种简单有效的检测异柠檬酸脱氢酶激酶/磷酸酶(AceK)活性的方法

对连续法间接测定异柠檬酸脱氢酶激酶/磷酸酶(AceK)活性方法进行改造和优化,摸索了底物用量、酶用量、反应时间等条件,建立了测定AceK活性的简便方法——终止法.实验表明:AceK活性需要金属离子Mg^(2+),其在反应体系中的浓度是2mmol·L^(-1);在激酶活性测定的实验体系中,反应时间和底物浓度分别为15min和3μmol·L^(-1).在磷酸酶活性测定的标准实验体系中,反应时间和底物浓度分别为15min和5μmol·L^(-1);对于激酶活性和磷酸酶活性,反应体系中AceK的最佳酶浓度都为1.0μmol·L^(-1);该方法在120min内稳定性较好.终止法测定的AceK激酶或磷酸酶的活性与同位素法测定的激酶或磷酸酶活性结果是一致的.

钙离子对钙调神经磷酸酶B亚基结构和功能的影响

应用原紫外CD光谱、内源荧光光谱以及ANS荧光光谱探究了Ca^(2+)对钙调神经磷酸酶(CN)调节亚基(CNB)结构和功能的影响.结果显示:Ca^(2+)能够激活CN磷酸酶活性提高到约1.5倍;CD谱显示结合Ca^(2+)后CNB出现α-螺旋含量上升、无卷曲含量下降、分子有序性升高等现象;!源荧光光谱显示结合Ca^(2+)导致CNB结构更加紧凑;ANS荧光光谱显示Ca^(2+)结合导致其疏水性增强.结合Ca^(2+)后,CNB分子有序性升高,结构更加紧凑,疏水表面暴露.这些结构变化促进了其与CNA的结合并激活了CNA的磷酸酶活性.

人神经母细胞瘤株SH-SY5Y中calcineurin比活性测定的最佳条件

研究了在人神经母细胞瘤株SH-SY5Y中calcineirin比活性测定的最佳条件.以RⅡ为底物,在测活缓冲液中,Ca2+和岗田酸(okadaic acid,OA)的加入是必须的,这与在脑组织中的测定是不一样的,同时进一步确定了需要加入的OA是100 nmol.L-1.在细胞破碎液中,calcineurin比活性的测定值是以缓冲液Ⅰ(含Ca2+与OA)中测得CN比活性数值减去缓冲液Ⅱ(含EGTA与OA)中所测比活性数值之差来表示.

钙调磷酸酶B亚基钙结合位点的突变对B亚基结构和功能的影响

应用远紫外CD光谱、紫外差光谱、内源荧光光谱以及ANS荧光光谱,探究了钙调磷酸酶B亚基钙结合位点的突变对B亚基结构和功能的影响.结果显示:钙结合位点突变体Y105W激活CNA的能力强于CNB;而E110Q活化CNA的能力弱于CNB;Y105W和E110Q与Ca2+亲和性低于CNB;CNB和它的突变体二级结构趋于一致,但三级结构存在明显差异,这种差异可能是它们功能差异的结构基础.

关于(A6,A11)-双位点突变胰岛素原作为外源肽呈递骨架可行性的研究

通过重组DNA技术,以(A6,A11)-双突变胰岛素原分子为支架构建了含有外源抗栓肽功能区的嵌合分子,并在大肠杆菌进行了表达和纯化.对嵌合分子进行胰岛素受体结合活性、放射免疫活性及抗血小板聚集活性分析,结果表明该嵌合分子具有较强的血小板聚集抑制活性,而无胰岛素生物活性,证明以(A6,A11)-双突变胰岛素原作为外源肽序列呈递骨架是可行的.

使用无细胞翻译体系合成尿激酶原突变体蛋白

应用无细胞翻译体系对KGD-尿激酶原重组蛋白质进行表达,表达产物以可溶状态存在,约占体系总蛋白质量分数的5%.使用亲和层析技术对表达产物进行纯化,纯化产物具有较好的分子均一性,并表现出明显的纤溶活性.

(A11,A12)胰岛素原移位突变体的表征研究

将(CysA11Ser,SerA12Cys)人胰岛素原移位突变体基因克隆至高效表达质粒pET22b多克隆位点区,构建重组表达质粒pET-A112,并在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)pLys中进行了表达.表达产物存在于包涵体中,通过包涵体的分离及二硫键变复性,获得A6-A12二硫键突变型的胰岛素原突变体.SDS-PAGE电泳显示突变型胰岛素原的电泳迁移率与野生型胰岛素原基本相同.质谱检测表明,突变性胰岛素原的分子结构均一、纯度良好,氨基酸组成与理论值基本一致.以野生型人胰岛素原为对照进行的胰岛素受体试验及胰岛素放射免疫试验表明,A6-A12二硫键错接型胰岛素原突变体的受体结合活性和放免活性是野生型胰岛素原的11%与55%.

桑黄素与钙调蛋白磷酸酶相互作用的研究

利用荧光光谱法和紫外吸收光谱研究药物小分子桑黄素(morin)与钙调蛋白磷酸酶(calcineurin,CN)在缓冲液中的相互作用,并结合Doking分子模拟对接进一步分析桑黄素与CNA的结合位点.结果表明:在缓冲液中,桑黄素与CNA的相互作用引起的荧光淬灭属于静态淬灭.采用位点结合模型公式和福斯特Foster非辐射能量转移机理求解出结合常数、结合位点数以及结合距离.结果显示桑黄素基本可以与CNA以1∶1的比例结合,主要结合位置位于催化区.Docking分子模拟对接实验结果也显示桑黄素与靶酶最可能的结合位点位于催化区.

槲皮苷:一种抑制钙调蛋白磷酸酶(CN)的新型免疫抑制剂

目的以钙调蛋白磷酸酶(CN)为靶酶,从中草药中寻找高效、低毒的免疫抑制剂。方法以CN为靶点,筛选并分离能够抑制其活性的天然化合物。在细胞和动物水平评价该化合物的免疫抑制效果及毒副作用,并通过荧光猝灭、分子对接、免疫印迹、双荧光素酶报告基因、实时定量PCR等实验探究天然化合物与CN的作用机理及可能的免疫抑制作用机制。结果槲皮苷在体外和细胞内均能抑制CN的活性,并且能够有效抑制小鼠脾细胞的增殖,缓解小鼠迟发超敏反应。毒理研究结果显示,槲皮苷对实验小鼠无急性毒性,且毒副作用很小。荧光猝灭实验和分子对接分析表明,槲皮苷可能与CN上的两个位点相结合,并通过CN-NFAT通路参与调节免疫反应。结论通过筛选获得了新型CN抑制剂槲皮苷。槲皮苷具有成为新型低毒免疫抑制剂的潜在可能。

活化的T细胞核内因子(NFAT)的调节及其在神经系统中的功能

活化的T细胞核内因子(nuclear factor of activated T-cells,NFAT)作为细胞信号转导通路中的一类重要的转录因子参与细胞功能的调节.NFAT的活化主要是通过细胞内钙/钙调神经磷酸酶(Ca2+/calcineurin)的刺激启动,它脱磷酸后发生核转位并与DNA的特定序列结合,同时通过与其它转录因子的协同作用,调节目的基因的特定表达.NFAT在免疫系统中所调节的基因表达已经得到了充分的研究.近年实验研究发现,NFAT的转录因子家族在脊椎动物的神经系统中也发挥着非常重要的作用.本文综述了NFAT家族蛋白的分类、结构、磷酸酶与激酶对其出入核的调节及在神经系统中的研究进展,使得能够更加全面地认识calcineurin/NFAT信号通路的作用.此外,由于环孢菌素A(cyclosporin A)等药物在神经系统应用的局限性,对于NFAT调节深入研究,也将为筛选或者开发更为高效、低毒药物提供新的思路.

人膜联蛋白的表达及性质初步研究

基于人膜联蛋白Ⅴ(Annexin Ⅴ)cDNA分子构建了相应的大肠杆菌融合表达体系.通过摸索和优化表达条件,表达并纯化出可溶的GST-重组人Annexin Ⅴ融合蛋白.通过活化部分凝血活酶时间(tAPT)实验测定表明,GST-重组人Annexin Ⅴ融合蛋白能有效延长tAPT,具有较强的抗凝活性,且延长时间与剂量成线性关系.

钙调蛋白磷酸酶B亚基生物学活性检测方法建立

建立钙调蛋白磷酸酶B亚基（calcineurin subunit B,CNB）生物活性检定方法用以质量控制.CNB能促进钙调蛋白磷酸酶A亚基（CNA）的突变体CNAΔ316的活性,增强其分解底物对硝基苯磷酸二钠（p-nitrophenylphosphate,p NPP）的能力.采用四参数方程对不同浓度CNB和相应的p NPP最大分解速率进行拟合,用平行线分析法对供试品和参考品进行量值传递,得到供试品的活性值.然后对该方法的准确度、精密度、线性、线性范围、灵敏度、特异性和耐久性进行验证.回收率结果均在98%以上,板内精密度为6.7%,板间精密度为10.8%,决定系数大于0.98,线性范围为0.05~50μg/m L,灵敏度为50μg/m L.部分细胞因子无法促进CNAΔ316分解底物p NPP的能力.在一定范围内,CNAΔ316浓度对检测结果没有影响.

天然兔源噬菌体单链抗体库的构建与鉴定

目的:构建天然兔源噬菌体单链抗体库。方法:采用RT-PCR法从未免疫的兔子脾脏中克隆得到抗体重链可变区(VH)与轻链可变区(VL)基因,重叠PCR将VH和VL拼接成scFv片段,将scFv连接到噬菌粒pComb3XSS上,电转入XL1-Blue菌中,得到单链抗体库,并用此抗体库筛选抗肌酸激酶抗体。结果:构建了容量为4×108,基因重组率95%的单链抗体库,DNA指纹图谱显示抗体库多样性良好。以肌酸激酶为抗原,从该库中筛到3株抗肌酸激酶的抗体。结论:分析表明构建的天然兔源单链抗体库质量良好,可用于快速筛选、制备多种单链抗体。

钙调素与靶蛋白结合模式的多样性

钙调素(CaM)通过与数百种靶蛋白结合,调节众多钙信号通路参与的生理活动。钙调素与靶蛋白的结合模式也是多种多样的,数年前就有多篇这方面的综述发表,最近的一篇发表于2006年。这之后的5、6年,又有大量钙调素-靶蛋白复合体的结构以及新型的结合模式发表,这其中就包括本实验室发表的钙调素与钙调蛋白磷酸酶(CN)的钙调素结合区(CBD)结合的晶体结构,为不同于经典模式的X形二聚体。本文在前人综述的基础上,结合本实验室的成果,以及其他近5、6年新发表的结构,从经典包围型、其他包围型、伸展型、IQ基序相关、二聚体型、大分子参与的结合模式共6个类别,讨论了30多种钙调素-靶蛋白复合体的结构。这些多样的结合模式为钙调素调节功能的多样性提供了结构基础,也为解析结构未知的钙调素-靶蛋白复合体提供了启示。