增殖细胞核抗原(PCNA)的分子结构及其生物学功能研究进展

增殖细胞核抗原(PCNA)是真核生物复制复合体的核心成分,具有特殊的环状三级结构．作为真核细胞DNA聚合酶δ的推动因子,与不同复制相关蛋白结合,协调DNA复制过程．同时PCNA还作为功能转换因子,通过不同调控方式与多种细胞因子作用,参与了DNA损伤修复、细胞周期调控及凋亡等许多重要的细胞事件．另外作为细胞增殖的指标,PCNA与肿瘤等细胞增殖性疾病的发生和发展存在相关性,因此在临床上对PCNA的深入研究有重要意义．文中就PCNA的“功能性”结构及其在不同细胞事件中的功能转换(Function Switch)进行简要综述．

北京鸭胆囊上皮细胞结构功能研究

从北京鸭分离胆囊上皮细胞,用MitoTracker Red定位上皮细胞胞浆的线粒体分布.发现在保留极性和失去极性的上皮细胞中,线粒体在胞浆中均匀分布.用乙酰胆碱(ACh)刺激分离得到的单个胆囊上皮细胞,以Fura-2-AM显微荧光测定胞浆中钙离子浓度的变化,发现ACh(10～20 μmol·L-1)可引起胞浆钙离子浓度的明显变化.

新鲜分离的北京鸭胰腺腺泡细胞中的功能性受体

对新鲜分离的北京鸭胰腺腺泡，用胆囊收缩素八肽（ＣＣＫ—８）、乌拉胆碱（Ｂｅｔｈ）、血管活性肠肽（ＶＩＰ）进行刺激，检测淀粉酶的分泌．发现ＣＣＫ－８，Ｂｅｔｈ可剂量依赖性地刺激淀粉酶的分泌，而ＶＩＰ对分泌没有刺激作用．ＣＣＫ—８对分泌刺激作用的量效曲线呈“钟罩”型．由此可见，在新鲜分离的北京鸭胰腺腺泡细胞中存在ＣＣＫ受体和胆碱能受体，不存在功能性ＶＩＰ，受体．

PS1/GFP融合蛋白对PS1的亚细胞定位的初步研究

PS1基因突变与早发家族性老年痴呆有密切联系。构建pEGFP-C1-PS1以及pEGFP-N2-PS1融合基因表达载体,于HEK293和CHO细胞系中表达PS1/GFP融合蛋白,以GFP绿色荧光作为PS1的亚细胞定位信号,通过SPOTII以及CONFOCAL显微镜进行观察,初步获得PS1全长蛋白在细胞中定位的部分信息,即PS1定位于细胞核膜,细胞质内有不均匀的分布,少量存在于细胞-细胞接触处的细胞膜上。

除草剂乙草胺抑制大鼠肝脏细胞肾上腺素能受体所介导的胞浆钙振荡(英文)

田间除草剂乙草胺施用之后非常容易进入地表水和地下水,河流溪水中乙草胺浓度可达纳摩尔水平,从而对水生生物产生长期影响.因职业关系而产生的皮肤暴露和吸入,可导致人血液乙草胺浓度达到微摩尔水平.对乙草胺体内动力学的研究,发现肝脏是乙草胺毒理作用的主要靶器官.已知在肝脏细胞多种生理功能中,钙离子发挥重要作用.本文研究在新鲜分离的大鼠肝脏细胞,乙草胺对肾上腺素能受体所介导胞浆钙振荡的可能影响.实验发现低浓度乙草胺(1、10μmol·L^(-1))对苯丙肾上腺素所诱导钙振荡没有影响,但是高浓度(50、100、200μmol·L^(-1))乙草胺在有些肝脏细胞可逆性抑制苯丙肾上腺素所诱导的胞浆钙振荡.在苯丙肾上腺素2次串联刺激之间短暂加入乙草胺(1、10、100μmol·L^(-1)),乙草胺对肝脏细胞基础钙浓度没有影响,也不影响第2次苯丙肾上腺素刺激所引发胞浆钙振荡.细胞免疫化学研究发现在新鲜分离的大鼠肝脏不同细胞,α1肾上腺素能受体密度存在明显差异.对固定的大鼠肝脏切片进行组织免疫化学检测,发现α1肾上腺素能受体在肝脏小叶的密度梯度分布:α1肾上腺素能受体密度从中央静脉方向到门脉方向从低到高逐渐增加.这种α1肾上腺素能受体的密度梯度分布,可能是乙草胺选择性抑制苯丙肾上腺素刺激分离大鼠肝脏细胞所诱发钙振荡的原因.本文数据揭示,在急性皮肤暴露或乙草胺中毒后可达到的血液浓度,短期施加乙草胺,可一过性抑制肝脏α1肾上腺素能受体所介导的胞浆钙振荡.长期乙草胺暴露,可能对肝脏细胞正常钙信号系统产生持续性不良影响.

枸杞多糖、牛膝多糖对H_2O_2诱导2BS细胞衰老的影响

目的:研究枸杞多糖(LBP)和牛膝多糖(ABP)对H2O2诱导2BS细胞衰老模型的影响。方法:应用MTT法测定细胞的增殖活性,检测衰老相关β半乳糖苷酶(SA—β—gal)染色情况,采用硫巴比妥酸(TBA)反应比色法测定细胞的丙二醛(MDA)水平,通过紫外分光光度法检测细胞的单胺氧化酶-B(MAO-B)活性,利用试剂盒检测细胞的超氧化物歧化酶(SOD)活性。结果:经H2O2处理后细胞形态出现衰老样改变,LBP和ABP均能提高经100μmol·L-1H2O2处理的2BS细胞的存活率,降低细胞的SA—β—gal染色阳性率以及MDA水平,抑制细胞的MAO-B活性,增强SOD活力。结论:以亚致死量H2O2处理年轻2BS细胞可以建立细胞衰老模型。LBP和ABP能够改善H2O2诱导的衰老模型细胞的某些表型,这可能与其抗氧化作用有关。

cdk2反义RNA对乳腺癌细胞增殖及致瘤性的抑制作用

为了研究 ｃｄｋ２对乳腺癌细胞生长及ｃｙｃｌｉｎＡ， ｃｙｃｌｉｎＢ１和ｃｄｋ１（ｃｄｃ２）ｍＲＮＡ表达水平的影响，利用真核表达载体ｐＸＪ４１－ｎｅｏ构建了表达ｃｄｋ２反义ＲＮＡ的重组载体，并用此载体转染了人乳腺癌细胞系Ｂｃａｐ３７，获得了ｃｄｋ２表达受到抑制的细胞模型Ｂｃａｐ３７－ＣＤＫ２ＡＳ，然后将Ｂｃａｐ３７－ＣＤＫ２ＡＳ细胞的生长能力及ｃｙｃｌｉｎＡ， ｃｙｃｌｉｎＢ１和 ｃｄｋ１ ｍＲＮＡ的水平与转入空载体的对照细胞进行了对比分析．结果显示ｃｄｋ２表达受到抑制时，细胞生长速率下降，根据测定出的细胞生长曲线，细胞培养至第７天时，细胞生长抑制率为６４％．在流式细胞术的分析结果中，Ｇ１期细胞占的百分比从３９％增加到４７％，Ｓ期细胞由５１％下降到３９％．棵鼠接种的实验表明，Ｂｃａｐ３７－ＣＤＫ２ＡＳ的致瘤性明显减弱．在对ｃｙｃｌｉｎＡ， ｃｙｃｌｉｎＢ１和ｃｄｋ１ ｍＲＮＡ的分析中发现， Ｂｃａｐ３７－ＣＤＫ２ＡＳ中这３种基因的ｍＲＮＡ水平均有不同程度的下降，依据这些结果可以推测，ｃｄｋ２反义ＲＮＡ可使乳腺癌细胞生长及致瘤性受到抑制，并且ｃｄｋ２表达的抑制将影响ｃｙｃｌｉｎＡ，ｃｙｃｌｉｎＢ和ｃｄｋ１的表达水平．

真核细胞DNA聚合酶δ的结构与功能

DNA聚合酶δ(Polδ)在真核细胞的DNA复制过程中具有核心酶的作用,同时还参与DNA的修复。Polδ是一种由多个亚基组成的复合体,目前已从哺乳动物、裂殖酵母和芽殖酵母等多种真核生物细胞中分离出,并对它们的亚基组成进行了分析,但还未得到确切一致的结果。Polδ在DNA复制中的具体作用已基本了解,它参与催化整个前导链的复制以及一些或大部分滞后链的复制。此外,Polδ还参与DNA的修复,此酶的这一功能可减少DNA的变异,但目前对其作用机理还知之较少。在Polδ活性调控方面,主要研究了一些相关蛋白因子对Polδ活性的调控作用以及转录因子对催化亚基表达的调控作用。

强力霉素抑制丝裂霉素诱导的MTEC1细胞凋亡及其蛋白质组初步分析

目的:探讨强力霉素(doxycycline,Dox)保护胸腺上皮细胞的作用及其机制,为进一步研究Dox的免疫调节作用奠定基础。方法:利用光学显微镜观察Dox对丝裂霉素(mitomycin,MMC)诱导MTEC1凋亡的影响,同时采用Hochest33342、PI单染、Annexin V和PI双染确认其作用,最后利用表面加强激光解析电离飞行时间质谱技术分析了SAX2芯片捕获的Dox作用前后的差异蛋白质。结果:通过形态学观察、Hochest33342、PI单染及Annexin V和PI双染发现Dox确实能保护MTEC1抵抗丝裂霉素诱导的细胞凋亡。随后采用表面加强激光解析电离飞行时间质谱技术分析SAX2芯片捕获蛋白,发现Dox能调控15种蛋白,其中上调8种,下调7种。结论:Dox具有保护MTEC1,抑制MMC诱导的细胞凋亡作用,并对MTEC1的蛋白表达有调控作用。

增强p53、p21及抑制c-myc表达对MCF-7细胞增殖的协同抑制作用

为了探讨增强p53、p21基因表达水平和降低c-myc基因表达水平对乳腺癌细胞MCF-7增殖的协同抑制作用,以及这些基因对细胞产生效应时的相互关系,本研究中首先构建了正义的p53、p21和反义的c-myc3种真核细胞表达载体,并根据析因实验设计三种载体不同剂量组合。按照组合用质粒转染细胞,然后对转染细胞的增殖抑制率进行检测,并采用金正均Q值法、单因素方差分析中的LSD法、聚类分析法等统计学方法对结果进行统计分析。结果显示,不同量的p53、p21反义c-myc对MCF-7细胞的增殖均有抑制作用,抑制的程度各基因间存在差异。在各基因组合中,p21与反义c-myc,p53与反义c-myc联用具有协同作用,对MCF-7细胞的增殖产生更强的抑制,而p53与p21之间未显示出协同作用。对三基因协同结果进行聚类分析后,发现第一类组合协同作用最明显,第九类组合的抑制率最高。由此推测,作为抑癌基因的p53或CDK抑制基因p21高表达,同时原癌基因c-myc表达受到抑制,可相互协同显著增强对MCF-7细胞增殖的抑制作用。

中心体异常在咖啡因增强顺铂杀伤人肝癌细胞系中的作用

为了探讨咖啡因是否影响细胞周期检验点而增强顺铂杀伤肿瘤细胞及其作用机制 ,选取同步化于S期的肝癌细胞系SMMC 772 1,用顺铂和咖啡因进行不同方式的处理 ,包括顺铂处理、咖啡因处理以及先经顺铂 ,再用咖啡因处理 .利用相关方法对不同处理的细胞进行了分析 ,包括细胞形态 ,细胞生长速率 ,多核细胞的形成与死亡 ,中心体的异常等 .结果显示 ,顺铂与咖啡因联合处理的细胞出现明显的多核化现象 ,多核细胞占总细胞的百分比可以达到 30 %以上 ,高于用顺铂或用咖啡因处理的细胞 .同时观察到多核细胞生存能力较差 ,它们会通过细胞凋亡的形式死亡 .抗中心体人自身免疫血清的免疫荧光结果显示 ,中心体异常与多核细胞的形成直接相关 .在部分多核细胞的核周围有多个不同强度的荧光点 ,在另部分多核细胞中 ,在其中央有一个大的荧光点 ,被多个细胞核围绕 ,荧光较强 .根据结果推测 ,由多个不完整的中心体导致的多极分裂形成多核细胞 ,随后多个中心体聚集到中央形成大的中心体 ,负责间期微管的组装 .结果表明 ,受到顺铂损伤的细胞由于检验点的作用而使细胞周期阻断 ,咖啡因可消除周期的阻断 ,使细胞在中心体未完成正常复制状态下进入有丝分裂 ,产生大量多核细胞 ,这些多核细胞最终发生凋亡 .

反义细胞周期蛋白E真核表达载体的构建及其对体外人乳腺癌细胞的抑制作用

为了探讨细胞周期蛋白 E(cyclin E)与人乳腺癌细胞恶性特征间的相关性 ,利用反义 RNA抑制基因表达的技术 ,构建了细胞周期蛋白 E反义 RNA的真核表达载体并转入人乳腺癌细胞中 .通过 G41 8筛选出阳性克隆 ,经 PCR和 Western印迹检测 ,确定细胞中含有重组质粒 ,并且细胞周期蛋白 E蛋白的水平明显降低 ,由此获得了反义 RNA表达载体导致的细胞周期蛋白 E表达受抑制的细胞 .细胞模型建立后 ,观察分析了细胞形态 ,细胞生长的血清依赖性以及软琼脂成集落能力 ,与对照细胞相比所发生的变化 .结果显示 ,细胞周期蛋白 E受抑制后 ,乳腺癌细胞体积变大 ,细胞生长对血清依赖性增加 ,低血清培养到第 6d时 ,细胞密度约为对照细胞的五分之一 ,细胞成集落能力也显著下降 ,软琼脂中克隆形成率下降 57% .这些变化都表明乳腺癌细胞恶性程度由于细胞周期蛋白 E表达受抑制而减弱 ,可以推测 cyclin E与乳腺癌细胞的恶性增殖及非锚定依赖性生长有着明显的关系 .

人端粒酶活性的调控机制及其新功能研究进展

端粒酶活性在胚胎发育过程中消失,人的绝大多数体细胞没有端粒酶活性,因而随着体细胞分裂次数的增加,端粒长度在不断缩短。当端粒缩短到一定程度时,细胞无法维持正常的端粒结构而导致细胞的衰老,而当细胞衰老调控机制失控的情况下,端粒的极限缩短将导致细胞死亡或癌变。端粒酶的活性在细胞癌变的过程中被重新激活以维持端粒的长度和结构,以及细胞无限增殖化的能力,与衰老及肿瘤的发生发展密切相关。随着人们对端粒酶认识的深入,新研究进展显示端粒酶具有独立于端粒之外的新功能,端粒酶在DNA修复、促进细胞存活、基因转录及刺激干细胞增殖等方面不依赖于端粒的新功能的发现,为阐明端粒酶在衰老及癌变中重要功能的分子机制提供了新的思路。

MCF-7细胞瞬时基因表达转染模式的建立

目的 建立一种高效、简便、低毒、价廉的瞬时基因表达细胞转染模式。 方法 选择人乳腺癌细胞 系MCF 7,采用Polyethylenimine(PEI)作为转染剂,对细胞密度、载体DNA量、PEI氮与DNA磷的比率(PEI N∶DNA P) 以及PEI DNA混合物与细胞共存的无血清培养时间等对转染效率的影响进行了比较分析。 结果 转染时的24 孔板每孔接种的细胞以2×105为宜,PEI N∶DNA P的最优比率不是固定的,它与转染时DNA的量有关,每孔转染1 μgDNA时其最优PEI N∶DNA P比率为33∶1左右,而每孔转染4μgDNA时其最优PEI N∶DNA P比率为9∶1左右。 另外,PEI DNA混合物与细胞共存的无血清培养时间至少需要3h,最佳时间为5～7h。 结论 利用转染剂PEI, 控制合适的细胞密度、DNA质量、PEI N∶DNA P比率和无血清培养的时间,可成为一种高效、简便、低毒、价廉的瞬时 基因表达的细胞转染模式。

内源性PS1在活体HEK293和HeLa细胞膜上的定位

目的检测内源性PS1在活体细胞膜上的定位及其表达。方法为防止细胞固定及通透使胞膜被破坏,在未经固定和通透的活体细胞上利用PS1抗体,通过间接免疫荧光法观察了内源性PS1在活细胞膜外表面的定位和表达;利用分子标签技术,构建GFP-PS1融合蛋白,瞬时转染细胞,检测到外源性PS1在细胞核膜的定位及在胞质中的少量分布;同时利用PS1抗体,将细胞固定及通透,用间接免疫荧光技术,检测到内源性PS1在细胞核膜中的定位及在细胞质中的少量不均匀分布。结果内源性PS1在定位于亚细胞结构的膜同时,也定位于细胞外膜。结论成功地在活体细胞外膜上检测到内源性PS1。

鼠PS1-GFP融合蛋白表达载体的构建研究

Presenilin1(PS1)的突变是早发家族性老年痴呆发生的重要因素之一。目前对于PS1结构和功能的研究表明,PS1作为一种多次跨膜并具有γ-secretase活性的蛋白酶,很可能参与众多的细胞信号传导通路,影响细胞分化和调亡、组织及个体的发育等等。但对于PS1的精细结构和功能目前了解甚少,为探讨PS1的精细结构和功能,本研究构建了鼠PS1-GFP融合蛋白表达载体。方法:我们设计了扩增PS1的cDNA全长的引物,以C57BL/6小鼠9天胚的RNA为模板,利用RT-PCR的方法从C57BL/6小鼠9天胚中获得PS1的cDNA,经测序确认后,将其克隆到pMD18-TVector中。设计引物:上游5’-GCCGAATTCTATGACAGAGATACCTGCACC-3’;下游5’-GAAGGATCCGATATAAAACTGATGGAATGC-3’,上游含有EcoRI酶切位点,下游含有BamHI酶切位点。利用高保真DNA聚合酶通过PCR方法将pMD18-T-PS1质粒中的PS1基因亚克隆到pEGFP-C1载体中,获得pEGFP-C1-PS1融合蛋白表达载体,然后利用EcoRI和BamHI从pEGFP-C1-PS1融合蛋白中切下PS1基因,从pMD18-T-PS1质粒中切下载体部分,经过连接,获得中间载体,利用该重组载体中的EcoRI和SalI酶切位点,酶切连接入pEGFP-N2载体中,获得pEGFP-N2-PS1融合蛋白表达载体,经测序鉴定后备用。

一个在小鼠头部特异表达的新基因BSG1 cDNA的克隆及研究

目的 克隆小鼠头部发育过程中特异表达的新基因并对新基因可能的功能进行初步分析。 方法采用消减差异筛选的方法筛选小鼠头部特异表达的新基因 ,并用生物信息学的方法对克隆到的新基因进行序列分析和蛋白结构域的预测。同时 ,还采用了小鼠胚胎原位杂交、小鼠脑部切片的原位杂交以及鸡胚的原位杂交方法研究BS6 1基因的表达情况。 结果 克隆到 1个与小鼠头部发育相关的新基因BSG1(brainspecificgene 1) ,其GenBank的登录号为AY2 10 4 0 2。该基因包含 1个 2 133bp的完整阅读编码框 ,编码 1个 710aa的C2H2型锌指蛋白。它与人的KIAA0 4 4 1基因在氨基酸水平上有 82 8%的同源性。该基因定位在小鼠的第 10号染色体上 ,含 7个外显子 ,6个内含子。BSG1主要在小鼠胚胎、鸡胚的头部表达 ,并且BSG1在小鼠头部表达的部位局限在海马、齿状回和小脑。 结论 BSG1是 1个可能的转录因子 ,在脑部特异表达。对其研究有助于进一步揭示大脑发育的分子机理。

中心体蛋白centrin研究进展

Centrin是普遍存在于中心体上的蛋白成分 ,具有钙离子结合能力。Centrin家族包含多种同源蛋白 ,这些蛋白在结构上高度保守。研究表明centrin可能与细胞的分化 ,纤毛的生成定向和切断 ,精子尾部的生成 ,中心体复制及其结构维持有密切关系 ,同时也和细胞的癌变、生长及细胞周期调控有关 。