过表达PKCβⅠ亚类2BS细胞模型之建立及与增殖相关性之初探

本文通过基因转染技术将大鼠蛋白激酶C(PKC)βⅠ亚类cDNA全长片段导入人胚肺成纤维细胞(2 BS)中,首次建立了一个稳定地过表达PKC βⅠ类的2 BS细胞模型。经实验证明在过表达PKC βⅠ亚类的细胞中PKC活性是对照细胞的三倍左右,表现出细胞增殖加速,进一步观察到与增殖有关的原癌基因c-myc的表达也明显加强。本文首次报道了PKC βⅠ在人胚肺细胞2 BS中加速生长与c-myc基因表达之密切相关性。这可能是PKC βⅠ作用于2 BS细胞生长加速的分子机理之一。

反义周期蛋白B1基因抑制HT29细胞的增殖

用ＤＮＡ重组技术将人类ｃｙｃｌｉｎＢ１基因的全长ｃＤＮＡ，反向插入到真核表达载体ｐＸＪ４１－ｎｅｏ的ＢａｍＨ１位点，得到ｃｙｃｌｉｎＢ１基因的反义ＲＮＡ表达载体ｐＡＳ－Ｂ１。利用ＤＮＡ磷酸钙共沉淀方法，将ｐＡＳ－Ｂ１转染进ＨＴ２９细胞。在含有Ｇ４１８的培养基中，挑选出独立的细胞克隆。利用ｃｙｃｌｉｎＢ１ｃＤＮＡ作探针，Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ杂交鉴定出一株内源性ｃｙｃｌｉｎＢ１ｍＲＮＡ受到抑制的细胞株ＨＴＢ１。比较ＨＴＢ１与对照细胞ＨＴ２９发现，ｃｙｃｌｉｎＢ１的反义ＲＮＡ明显抑制ＨＴ２９细胞的增殖，细胞内３Ｈ－ＴｄＲ参入量减少。流式细胞光度术分析，处于Ｇ１期细胞比率的升高与Ｓ期、Ｇ２＋Ｍ期细胞数量的下降都十分显著。

人肺癌细胞中蛋白激酶C亚类与cAMP-PKA系统相关性的研究

为了探讨蛋白激酶Ｃα（ＰＫＣα）及其与环腺苷酸－蛋白激酶Ａ（ｃＡＭＰ－ＰＫＡ）信号系统的相关性，用六甲撑双乙酰胺（ｈｅｘａｍｅｔｈｙｌｅｎｅｂｉｓａｃｅｔａｍｉｄｅ，ＨＭＢＡ）和ＰＫＣ抑制剂ＣａｌｐｈｏｓｔｉｎＣ分别处理人肺癌细胞ＬＴＥＰａ－２，统计细胞生长百分数，测定ｃＡＭＰ水平。用斑点杂交方法检测ＰＫＣα基因表达，并测定表达反义ＰＫＣα的人肺癌ＬＴＥＰａ－２细胞中ＰＫＣ与ＰＫＡ激酶活性。结果显示：５μｍｏｌ／ＬＨＭＢＡ处理人肺癌ＬＴＥＰａ－２细胞３ｄ后，细胞增殖明显被阻抑，ＰＫＣα基因表达下降，ｃＡＭＰ水平升高。０．１５ｍｇ／ＬＰＫＣ抑制剂ＣａｌｐｈｏｓｔｉｎＣ导致人肺癌细胞增殖速度减慢时，ｃＡＭＰ水平也升高。在表达反义ＰＫＣα的人肺癌ＬＴＥＰα－２细胞中，当ＰＫＣα基因和蛋白表达被阻抑、ＰＫＣ活性明显降低的同时，ＰＫＡ活性则显著升高。结果提示：在人肺癌细胞中ＰＫＣα亚类和ｃＡＭＰ－ＰＫＡ通路显示出拮抗关系。ＰＫＣα和ＰＫＡ两套信号系统相互作用。

CENP—B的基因表达与细胞周期关系的研究

本文以HeLa细胞为材料研究一种着丝粒蛋白CENP-B的基因表达与细胞周期及细胞核骨架的关系。将HeLa细胞同步在不同周期时相,以流式细胞光度术、同位素掺入和ACA着丝粒染色等方法检测细胞同步化效果。我们分别提取了各周期时相细胞的总RNA和Poly(A)^+RNA,用Dot blot和Northern blot杂交方法研究CENP-B在细胞周期中的表达。结果表明,CENP-B基因在细胞周期中的各个时相均有表达,但表达的强度差别很大:G2期表达最强,S期最弱,G1期中的表达介于二者之间;有意义的是CENP-B基因在M期仍然有较强的表达,表现出其在细胞周期中表达的持续性;这种表达的持续性反映了一种可能性:着丝粒、动粒蛋白不断合成,但直到S期后进入G2期时着丝粒、动粒蛋白到一定临界浓度时才开始组装新的动粒。另外,着丝粒、动粒蛋白的持续合成对着丝粒、动粒功能的发挥可能是必需的。用Bam H I限制性内切酶消化处于不同细胞周期时相的HeLa细胞核骨架,提取与核骨架紧密结合的DNA,用^(32)P标记的cDNA为探针研究CENP-B基因与细胞核骨架的结合与其表达的关系。结果证明,在G2期细胞中CENP-B基因表达最强,与细胞核骨架结合最为紧密,G1期细胞中次之,S期中CENP-B基因与核骨架结合最弱,说明CENP-B基因与细胞核骨架结合的紧密度影响其表达强度。

哺乳类细胞中周期蛋白依赖激酶抑制因子

近两年，人们相继发现了一组能结合性抑制周期蛋白依赖激酶（ＣＤＫｓ）活性的蛋白因子──ＣＤＫ抑制因子（ＣＫＩｓ）。它们分别是：ｐ２１、ｐ１６、ｐ１５、ｐ２７和ＣＤＩｌ。ｐ２１和ｐ２７有一定同源性，能抑制多种ＣＤＫｓ的活性；ｐ１６和ｐ１５则同源性更高，能特异地与ＣＤＫ４、ＣＤＫ６结合；ＣＤ１１的结合特异性还有待进一步的研究。ｐ２１的表达受ｐ５３的正调控；ＴＧＦ－β则上调ｐ１５的表达以及ｐ２７的抑制活性。以上表明ＣＫｌｓ不仅是ＣＤＫｓ活性的调控者，而且还是抑癌因子与细胞周期调控之间的直接联系者。

着丝粒蛋白B在基因组未复制的有丝分裂期细胞中的表达

着丝粒蛋白Ｂ（ＣＥＮＰ－Ｂ）主要位于染色体着丝粒区域的中心域，是一种ＤＮＡ结合蛋白，与染色体着丝粒、动粒的结构形成与功能实施有关。本研究结果显示咖啡因可以诱导ＣＨＬ细胞发生ＭＵＧ细胞。利用核酸杂交技术证明了在ＣＨＬ细胞中存在ＣＥＮＰ－Ｂ基因，并研究了咖啡因诱导ＭＵＧ细胞形成过程中ＣＥＮＰ－Ｂ的基因表达。发现ＣＥＮＰ－Ｂ在ＭＵＧ细胞形成整个过程中均有表达，表现出表达持续性。这与我们在ＨｅＬａ细胞中发现的ＣＥＮＰ－Ｂ在细胞周期各时相均有表达的结论一致。说明着丝粒蛋白处于不断合成中，着丝粒是一个动态的结构。

钙调素高表达对NRK细胞中DG-PKC和cAMP-PKA水平的影响

钙调素（ＣａＭ）作为Ｃａ２＋的主要受体，对细胞增殖起重要调节作用，而且在转化细胞中ＣａＭ的水平明显高于正常细胞．ｃＡＭＰ作为一种第二信使，起着将细胞外刺激信号转化为细胞内各种生理活动的媒介作用．蛋白激酶Ａ（ＰＫＡ）则是这种转化过程中的关键激酶．蛋白激...

抑制PKCα对乳腺癌细胞特性及cyclin E和CDK2基因表达的影响

将构建的表达PKC_α反义RNA的质粒,转入人乳腺癌细胞Bcap-37中,通过筛选与检测获得PKC_α表达受到抑制的细胞。随后分析了细胞生长的血清依赖性、软琼脂成集落和致瘤性的变化,以及cyclin E和CDK2基因表达所受到的影响。结果显示PKC_α表达受到抑制后,乳腺癌细胞生长的血清依赖性增加,软琼脂成集落能力下降,细胞致瘤性被强烈抑制,说明PKC_α表达下降或活性降低伴随着乳腺肿瘤细胞恶性程度的减弱。同时,结果还表明PKC_α表达受到抑制后,导致细胞周期调控系统中的cyclin E及CDK2表达水平下降,说明PKC_α参与的信号转导系统与cyclin/CDK参与的细胞周期调控系统在功能上有着较为密切的联系。

反义p21Cipl抑制RA诱导人白血病细胞HL-60的分化

全反式维甲酸(all-trans retinoic acid,at RA)可诱导缺乏内源p53基因的人白血病细胞HL-60的粒细胞分化,在此过程早期,人p21周期蛋白依赖激酶抑制因子(Cyclin-dependent Kinase interacting protein,Cipl)的表达即有所增加,并且不依赖p53。将反应p21Cipl重组质粒转染进HL-60细胞,建立锌调表达反义p21Cipl的细胞系HLAC,再用RA诱导,发现反义p21Cipl可部分抑制HL-60细胞的分化,而此时CDK4和cyclin D3的表达在HLAC中明显增加,证明p21Cipl参与了这一分化过程的起始,CDK4和cyclin D3可能与这一过程密切相关。

HeLa细胞G2/M/G1进程中PKA、PKC与CDC2活性变化相关性之初探

为了研究上游信使系统中两个重要激酶——蛋白激酶Ｃ（ｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅＣ，ＰＫＣ）和蛋白激酶Ａ（ｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅＡ，ＰＫＡ）与周期进程的相关性。采用胸腺嘧啶核苷（ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ，ＴｄＲ）双阻断和笑气（Ｎ２Ｏ）Ｍ期阻断相结合的方法，获得同步化的Ｇ２和Ｍ期细胞，并以此为模型，检测了信使系统中两个重要的蛋白激酶ＰＫＡ、ＰＫＣ以及Ｍ期引擎分子ＣＤＣ２在ＨｅＬａ细胞Ｇ２／Ｍ和Ｍ／Ｇ１过程中激酶活性变化情况，结果显示，ＰＫＣ和ＰＫＡ与ＣＤＣ２活性变化分别呈正负相关性。

PKC刺激与抑制对HeLa细胞G_1/S期进程的影响

蛋白激酶Ｃ（ｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅＣ，ＰＫＣ）是一类分布广泛的丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶，在真核细胞的跨膜信号传递中发挥重要的作用［１］．而细胞周期进程是一个复杂的调控过程，受控于多种磷酸酶与磷酸激酶作用下的中心调控体系［２］．大量报道表明ＰＫＣ信号...

PKC_γ过表达诱导C_3H_(10)T_(1/2)细胞生长失控的初探

通过ＤＮＡ 重组构建蛋白激酶Ｃγ（ＰＫＣγ） 亚类的重组质粒并经基因转染技术和ＤＮＡ 印迹、蛋白质印迹与ＰＫＣ活性分析， 获得了过表达ＰＫＣγ的Ｃ３ Ｈ１０ Ｔ１／２ 细胞———ＮＣＰ４ ． ＮＣＰ４ 细胞生长速率提高， 流式细胞光度术检测表明， ＮＣＰ４ 细胞Ｇ１ 期百分率下降， Ｓ期和Ｇ２ ＋ Ｍ 期百分率升高， 与对照组细胞相比， 血清依赖性明显下降， 贴壁依赖性降低， 在软琼脂中形成小集落， 出现部分转化表型． 进一步检测， 首次观察到ＮＣＰ４ 细胞中癌基因ｃｓｉｓ 表达明显增强， 这可能是ＮＣＰ４ 细胞血清依赖性下降的分子机理之一． 实验表明， 在正常Ｃ３ Ｈ１０ Ｔ１／２ 细胞中ＰＫＣγ的过表达可直接导致细胞增殖加速并可诱导出现部分转化特征．

蛋白激酶C活性的阻抑对人胃癌细胞BGC－823恶性表型的影响

以人胃癌细胞ＢＧＣ－８２３为模型，在佛波酯（ｐｈｏｒｂｏｌ１２－ｍｙｒｉｓｔａｔｅ１３－ａｃｅｔａｔｅ，ＰＭＡ）导致蛋白激酶Ｃ（ＰＫＣ）负效应条件下，探讨了ＰＫＣ活性的阻抑与细胞恶性表型变化的相关性及其可能作用机理。ＰＭＡ（１００μｇ／Ｌ）处理ＢＧＣ－８２３细胞７２ｈ，细胞质、膜和核中ＰＫＣ活性分别下降３５．６％和７２．３％。经电泳分析，观察到细胞核蛋白质磷酸化水平也明显下降。在ＰＫＣ活性被阻抑的同时，人胃癌细胞形态发生变化，细胞呈单层生长，出现接触抑制，在软琼脂中不能形成集落。表现出部分恶性表型丢失，并且与人胃癌细胞恶化密切相关的癌基因Ｈａ－ｒａｓ基因表达也明显被阻抑。这可能是ＰＫＣ活性被阻抑引起人胃癌细胞部分恶性表型丢失的分子机理之一。

过表达蛋白激酶CβⅠ亚类导致人胚肺成纤维细胞表型转化的研究

为探讨ＰＫＣ亚类在细胞增殖与转化中的可能作用，用稳定的过表达蛋白激酶Ｃ（ｐｒｏｔｅｉｎｋｉ－ｎａｓｅＣ，ＰＫＣ）βⅠ亚类的人胚肺成纤维细胞２ＢＳ（ＢＳ－ＰＫＣ３）为模型，研究了ＰＫＣβⅠ亚类对２ＢＳ细胞生长与转化的影响。结果表明，过表达βⅠ的２ＢＳ细胞形态发生变化，单层培养时出现堆积生长，表明丧失接触抑制。进一步观察到实验组细胞中血清生长依赖性下降，贴壁依赖性降低，在软琼脂中可形成集落，同时细胞中微丝发生部分解聚。某些原癌基因如ｃ－ｓｉｓ、ｃ－Ｈａ－ｒａｓ的表达加强，而抑癌基因Ｒｂ的表达则下降。实验表明，过量表达ＰＫＣβⅠ可导致正常２ＢＳ细胞生长调节紊乱，诱导２ＢＳ细胞出现部分转化表型。因此可能在致癌多阶段过程中ＰＫＣβⅠ的活化发挥着重要作用，一些原癌基因表达的增强和抑癌基因表达之阻抑可能是ＰＫＣβⅠ作用于２ＢＳ细胞生长调节失控的分子机理之一。

利用原位杂交分析几种cyclin和CDK基因在人乳腺癌中的异常表达

目的探讨细胞周期调控基因ｃｙｃｌｉｎ和ＣＤＫ的异常与乳腺癌发生的相关性。方法采集２０例乳腺癌外科手术样品，用原位杂交技术分析了ｃｙｃｌｉｎＤ１、Ｄ３、Ｅ、ＣＤＫ２和ＣＤＫ４ｍＲＮＡ的表达。结果在大多数乳腺癌样品中，这些基因有一种或几种出现高表达。ｃｙｃｌｉｎＤ１高表达的样品１７例（８５％），ｃｙｃｌｉｎＤ３有１２例（６０％），ｃｙ－ｃｌｉｎＥ有７例（３５％），ＣＤＫ２有６例（３０％），ＣＫＤ４有１６例（８０％）。ｃｙｃｌｉｎＤ１和ＣＤＫ４显色最强，其次是ｃｙｃｌｉｎＤ３，ｃｙ－ｃｌｉｎＥ和ＣＤＫ２显色较弱，正常乳腺组织为阴性显色。结论推测ｃｙｃｌｉｎ和ＣＤＫ基因，特别是ｃｙｃｌｉｎＤ１和ＣＤＫ４的异常表达与乳腺癌的发生有密切关系。

分化抑制因子(Id)家族研究进展

分化抑制因子（Ｉｄ）蛋白能够与很多螺旋－环－螺旋（ＨＬＨ）转录因子相结合形成无功能活性的异二聚体，抑制这些蛋白起始一些分化重要基因的转录，以达到其抑制分化的作用。同时还在阻断细胞周期，阻止细胞增殖方面有重要作用。以上结果表明，Ｉｄ蛋白在细胞分化及增殖中起重要作用，而且对发育畸形、癌症等疾病的发病机理的研究有所帮助。

PKCα反义RNA对乳腺癌细胞增殖及cyclinD1和CDK4表达的影响

PKC ,cyclin和CDK基因直接参于调控细胞的增殖与分化 ,因此它们在细胞癌变中的作用已成为重要的研究课题 .利用反义RNA技术抑制PKCα基因的表达 ,然后观察分析了乳腺癌细胞增殖的变化以及对cyclinD1和CDK4基因表达的影响 .结果显示 ,PKCα的表达受到抑制后 ,细胞增殖速率明显减慢 ,cyclinD1与CDK4的表达水平下降 .由此表明 ,PKCα在细胞癌变中具有重要作用 ,同时还说明作为信号传导系统中的重要因子PKCα与cyclin/CDK细胞周期调控系统间在基因表达上有密切关系 .

CDK4反义RNA对乳腺癌细胞增殖及cyclinD1,cyclinE和CDK2表达的影响

利用反义RNA抑制乳腺癌细胞中CDK4基因的表达 ,观察分析了此基因与癌细胞增殖速率、成瘤性以及与cyclinD1 ,cyclinE和CDK2表达的相关性 .当CDK4表达受到抑制后 ,细胞的增殖速率和致瘤性明显降低 ,显示出CDK4在乳腺肿瘤发生与发展中的重要作用 .cy clinE基因的表达水平有较大程度的下降 ,cyclinD1和CDK2基因表达水平变化较小 ,可以推测cyclinE的表达依赖于CDK4的诱导 .这样 ,CDK4表达的抑制不仅影响自身的作用 ,还影响其他基因的表达 ,细胞周期进程由此受到精确的调控 .

PKCa对人胚肺细胞增值相关基因表达及AP-1活性的影响

蛋白激酶C（Protein kinase C,PKC）是一类丝氨酸和苏氨酸激酶,它在细胞信号传递、生长调控和肿瘤发生中具有重要作用。PKC是一个至少由12种亚类组成的多基因家族,PKC亚类的分子异质性、不同的生化性质和细胞内定位暗示其发挥不同的生理功能,为了探讨特异PKC亚类在细胞增殖、转化中的作用,我们建立了稳定过表达PKCa的人胚肺细胞模型,分析表明过表达PKCa可以促进2BS细胞的增殖速率,并能引起细胞的部分转化特征,细胞外信号一般通过细胞核内基因表达的变化最终导致细胞表型的改变。

蛋白激酶Ca亚类真核表达质粒的构建和过表达细胞模型的建立及初步分析

蛋白激酶C(Protein kinase C,PKC)是依赖于Ca^(2+)和磷脂的多功能蛋白激酶,它在细胞信号传导、生长调节、肿瘤发生中发挥重要作用.分子克隆技术表明PKC是由多基因家族编码,迄今已发现至少12种亚类,各亚类在细胞中的生理功能各有差异.为了进一步探讨特异PKC亚类在细胞生长调控中的作用,我们构建了PKCα亚类的真核表达质粒,并通过基因转染的方法导入正常人胚肺细胞(2BS),首次建立了过表达PKCα的2BS细胞模型,并对此模型进行了初步分析.