抗体修饰DNA测序酶的开发及其应用

【目的】开发一种新型DNA测序酶,解决一代测序技术应对复杂DNA结构模板所面临的主要挑战,如测序信号中断或测序信号快速衰减。【方法】从NCBI数据库中挖掘到了Taq DNA聚合酶和单链结合蛋白SSB基因信息,利用遗传融合、定点突变及基因设计技术获得了一种新型的测序酶Sso-Sequenase。利用亲和层析和离子交换层析,获得了纯化的测序酶。利用抗体修饰技术改良了Sso-Sequenase的性能,并且利用STR技术对其热启动性能进行了表征。选取多组不同类型的复杂模板,采用一代技术对比分析了Sso-Sequenase测序酶试剂盒和传统BigDye测序试剂盒的测序表现。【结果】Sso-Sequenase在大肠杆菌中稳定表达,纯度达到95%以上,产量高达10.5 mg/L。当温度低于35℃时,Sso-Sequenase表现出热启动活性。在复杂模板的一代测序反应中,如重复序列、高GC和发夹结构等样本,Sso-Sequenase测序酶成功完成了所有样本的测序,序列的平均碱基质量QV大于20。相比而言,BigDye测序试剂盒在处理这些复杂样本时,多数样本测序信号出现了显著衰减或中断。【结论】开发了一种纯度好、产量高,兼具热启动活性的DNA测序酶Sso-Sequenase及测序试剂盒,显著提高了复杂DNA结构模板(重复序列、高GC和发夹结构)测序成功率。

质粒DNA Fast NGS测序方法的开发和应用

质粒DNA是最常用的基因运载工具,在基因合成技术中扮演着至关重要的角色。如何实现合成质粒DNA的准确且快速检测,是确保基因组完整性和提高基因合成效率的关键。尽管基于一代DNA的测序方法,其准确性已成为行业标准,但在检测通量、检测速度和检测成本等方面仍然存在局限性,这促使科学家们不断寻求新的解决方案。基于生物酶库,开发了DNA建库酶TN5,建立了高通量质粒DNA检测方案——Fast NGS。利用不同长度、不同质量的质粒DNA样本评估了Fast NGS的可行性,并对质粒DNA样本进行了高通量测序,最后对比了Fast NGS与Sanger测序的效率。结果表明,DNA建库酶TN5蛋白的纯度和质量符合二代测序要求。Fast NGS适用于3~8 kb基因合成质粒的测序检测,其检测通量高达2500个·12 h-1,测序成功率超过95%,测序准确性与一代测序相当,并且无明显序列偏好性。Fast NGS实现了质粒DNA的高通量、快速且低成本检测,为基因合成技术的发展提供了新的方向。

基于常压室温等离子体诱变和高通量筛选选育L-色氨酸高产菌株

L-色氨酸是人体中不可或缺的必需氨基酸,由于其广泛的应用和国内外巨大的需求,L-色氨酸已成为备受关注的研究和产业发展方向。尽管非理性诱变育种策略是一种开发工业菌株的有效手段,但是如何筛选具有理想表型的菌株依然是一个重大挑战。为了提高筛选L-色氨酸高产菌株的效率与准确性,本研究通过常压室温等离子体诱变构建随机突变文库,并结合深孔板高通量筛选,基于能够特异性响应L-色氨酸的拟荧光蛋白传感器从随机突变文库中成功筛选出一株L-色氨酸高产菌株,其产量在摇瓶中达到1.99 g/L,较出发菌株提高了41.77%。还通过基因组与转录组的比较组学分析,进一步对菌株的高产机理进行了解析。本研究基于常压室温等离子体诱变和高通量筛选策略,成功筛选出L-色氨酸高产菌株,为后续进一步选育和开发相关优质的L-色氨酸生产菌株资源提供了坚实的研究基础。

双磁珠法质粒DNA提取技术及应用

质粒是基因合成与测序领域中使用最为频繁的基因运载工具,然而传统的质粒DNA提取方法面临提取通量低、生产成本高等问题,无法满足日益增长的需求。本研究基于质粒提取原理,开发了双磁珠法(double-magnetic-bead method,DMBM)质粒提取技术,探究了磁珠投入量、质粒DNA片段大小、菌液投入量等因素对质粒提取的影响,并且对比了本技术与商业化质粒DNA提取试剂盒提取DNA质量、提取通量及提取成本。结果表明,双磁珠法质粒DNA提取技术可满足不同细胞密度、不同片段长度的质粒DNA提取。此外,该技术搭载96通道全自动核酸提取仪,提取的质粒DNA纯度更高、提取时间缩短80%、提取成本缩减57.1%,从而实现了质粒DNA提取的高通量、低成本,有效助力基因合成与测序。