浅谈基于风险的疫苗临床试验监查的应用研究

目的:通过研究危害分析和关键控制点(HACCP)方法,结合疫苗临床试验现场步骤或环节风险评估实例,从实际应用角度出发,提出基于风险制定疫苗临床监查策略的意见建议。方法:运用文献分析方法、案例分析法,分析和借鉴成功的经验。结果与结论:我国的疫苗研制单位应根据具体临床试验特点和法规要求,对临床现场各步骤或环节进行风险评估,根据评估结果合理制定并实施监查策略,达到保证临床试验科学规范、真实可靠的目的。此外,也可将此方法应用到所有药品临床试验领域,有效确保临床试验质量。

以无细胞百白破疫苗为基础的联合疫苗的研究进展

联合疫苗(combined vaccine)是将2种或2种以上不同生物体或提纯抗原通过物理方法混合后制成的单一疫苗制剂。联合疫苗的使用能够减少免疫针次,提高儿童的依从性及家长的接受度;降低运输、储存和管理成本;避免漏种,提高疫苗接种率。目前,国外已有多种联合疫苗上市,且具有较好的安全性和免疫原性;国内已有部分联合疫苗上市,还有多种联合疫苗处于临床试验阶段。近年,随着国内组分百日咳疫苗、Sabin株Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型脊髓灰质炎病毒灭活疫苗研发的成功,以无细胞百白破疫苗为基础的联合疫苗得到了较大发展。本文就国内外已上市和临床试验中以无细胞百白破疫苗为基础联合疫苗的研究进展作一综述,以期为国内相关联合疫苗的研发提供思路。

不同胰蛋白酶在制备腮腺炎减毒活疫苗中的效果比较

目的比较基因重组胰蛋白酶和猪源胰蛋白酶在腮腺炎减毒活疫苗中的使用效果。方法使用浓度为10%、15%、20%基因重组胰蛋白酶制备鸡胚成纤维细胞,通过细胞密度、细胞活性、24 h以及48 h细胞贴壁状态等指标确定基因重组胰蛋白酶使用浓度;与猪源胰蛋白酶进行比较,通过细胞密度、细胞活性、48 h细胞贴壁状态以及病毒滴度等指标比较两种胰蛋白酶的使用效果;使用基因重组胰蛋白酶制备3批腮腺炎减毒活疫苗,检定疫苗的稳定性;规模化放大验证该工艺的稳定性。结果通过研究发现基因重组胰蛋白酶的使用浓度为15%;与猪源胰蛋白酶进行比较,两种胰酶制备的细胞密度水平一致,无显著性差异(P>0.05),48 h后细胞均生长至单层,细胞状态良好,按照同一MOI进行接毒,病毒滴度无显著性差异(P>0.05);使用CF-10进行试验,病毒滴度也无差异(P>0.05);连续3批使用基因重组胰蛋白酶制备的疫苗热稳定性良好,且该工艺可以规模化放大。结论在制备腮腺炎减毒活疫苗中可以使用浓度15%的基因重组胰蛋白酶替代猪源胰蛋白酶,作为鸡胚成纤维细胞消化液使用。

Vero细胞生长过程中葡萄糖消耗量与细胞数量关系的研究

目的:建立一种应用于片状载体培养的Vero细胞计数方法。方法:Vero细胞于细胞瓶内培养,分别于24 h、48 h、72 h、96 h和120 h取样检测上清液中葡萄糖含量,同时消化细胞并计数。以葡萄糖累计消耗量为X轴,以细胞收获数量为Y轴,获得葡萄糖累计消耗量和细胞数量的关系方程,从而建立一种细胞计数的方法。通过计算反应器中细胞生长消耗的葡萄糖量来计算细胞数量,从而优化控制细胞生长。结果:得到葡萄糖消耗量与细胞数量线性方程为Y=4.107×10~8X;Vero细胞在反应器内培养6 d,累计消耗葡萄糖71.28 g,所获得细胞数量为2.93×10^(10)个。结论:建立了葡萄糖消耗量与细胞数量的线性关系,即每消耗1 g葡萄糖对应的细胞数量为4.107×10~8个,可作为片状载体细胞培养过程中细胞计数的参考。

重组肠道病毒71型疫苗的免疫原性和保护效果研究

目的评价重组肠道病毒71型(EV-A71)疫苗的免疫原性和保护效果.方法将重组EV-A71疫苗按0、14d程序免疫BALB/c小鼠,采用微量细胞病变法测定一针免疫、二针免疫14d后的EV-A71中和抗体效价,应用酶联免疫吸附法测定二针免疫14d后小鼠脾单个核细胞分泌的细胞因子水平.乳鼠颅内攻击EV-A71病毒,同时将疫苗免疫后小鼠血清通过腹腔注射乳鼠,计算乳鼠生存率及半数动物保护性抗体水平.结果重组EV-A71疫苗一针免疫小鼠后诱导产生的EV-A71中和抗体阳转率即达100%,二针免疫小鼠后诱导产生的EV-A71中和抗体效价显著高于一针免疫(P=0.000),疫苗可诱导小鼠产生Th1和Th2类细胞因子应答.乳鼠颅内攻击20μl原倍EV-A71/M6病毒,同时将疫苗免疫小鼠血清160、40、10、2.5、0.625和0.15625U分别经腹腔注射乳鼠,连续观察22d,乳鼠生存率分别为100%、100%、70%、20%、0和0,对照组乳鼠于第8天全部死亡,采用Reed-Muench法计算平均半数动物保护中和抗体效价(ED50)为5.59U.结论重组EV-A71疫苗可诱导小鼠产生良好的体液免疫和细胞免疫应答,并可保护乳鼠免受EV-A71病毒感染.

腮腺炎疫苗的研究进展

腮腺炎是由腮腺炎病毒感染导致的急性呼吸道传染病,通过飞沫在空气中进行传播,主要发生在儿童和青少年人群,症状多为全身多系统多器官感染,同时该病毒也可感染成年人,通常不引起发病,但可作为病毒携带者传播疾病。流行性腮腺炎的发病率高,传染性强,可感染中枢神经系统导致死亡,严重影响人类健康。自20世纪60年代起,随着腮腺炎减毒活疫苗在全球范围内的广泛应用,腮腺炎的发病率显著降低,但近年来许多国家腮腺炎在疫苗免疫人群中再次暴发,亟需研制有效疫苗来控制腮腺炎的流行。为了解腮腺炎病毒及其疫苗的研究进展,本文对腮腺炎病毒的基因结构和流行情况、腮腺炎再次暴发流行的可能原因和腮腺炎疫苗的国内外研究进展作一综述。

RD细胞库的建立及其相关研究

目的建立人恶性胚胎横纹肌瘤(human rhabdomyosarcoma,RD)细胞工作细胞库,并对RD细胞工作细胞库应用于肠道病毒灭活疫苗滴度的测定及中和抗体检测的可行性进行相关研究。方法建立工作细胞库,按照《中华人民共和国药典》对其进行检定,包括细胞活力、细胞形态、无菌检查、支原体及细胞外源病毒因子检查等,并对RD细胞生长曲线、传代稳定性及肠道病毒敏感性进行研究。结果实验建立的RD细胞工作细胞库呈梭形、大的多核上皮样细胞形态,有良好的生长状态,细胞活率为98.85%,无菌检查、支原体以及细胞外源病毒因子指标均符合规定。RD细胞生长曲线呈S型,细胞在3~6 d进入对数生长期,而后到达平台期,细胞倍增时间为27 h,连续传20代细胞形态正常。不同代次RD细胞检测肠道病毒71型(enterovirus 71,EV-A71)、柯萨奇病毒A组6型(coxsackievirus 6,CVA6)、柯萨奇病毒A组10型(coxsackievirus 10,CVA10)、柯萨奇病毒A组16型(coxsackievirus 16,CVA16)肠道病毒的滴度均值分别为(8.20±0.07)、(7.84±0.12)、(7.93±0.09)、(7.34±0.16)lgCCID/ml,变异系数(coefficient of variation,CV)在0.88%~2.12%。结论建立的工作细胞库符合《中华人民共和国药典》规定,传代稳定性良好,RD细胞对肠道病毒较为敏感,可以用于肠道病毒疫苗相关病毒滴度的测定及疫苗中和抗体检测.

肠道病毒A组71型病毒参考品的建立及应用

目的建立肠道病毒A组71型(enterovirus A71,EV-A71)灭活疫苗病毒参考品,用于病毒滴度内部质控品及灭活效果验证实验室评价。方法建立1批病毒参考品,按照《中华人民共和国药典》对其进行检定,包括无菌、支原体及分子生物学鉴定检查等。对其滴度进行标定和储存稳定性研究,并进行病毒滴定和灭活效果验证方面的应用研究。结果建立的EV-A71病毒参考品无菌检查及支原体检查结果均符合规定。分子生物学鉴定结果显示参考品只含有单一的EV-A71 VP1特异性条带。EV-A71病毒参考品标定后的滴度平均值为7.000 lgCCID_(50)/ml(95%CI为6.917~7.083 lgCCID_(50)/ml),可接受范围为6.566~7.434 lgCCID_(50)/ml,变异系数(coefficient of variation,CV)为3.01%,于-60℃及以下存放12个月的CV为2.08%,稳定性良好。将参考品作为病毒滴定测定的内部质控品应用于日常监测50次试验,滴度趋势分析结果显示未出现超趋势现象(out of trend,OOT)且均在警戒限内;将参考品作为阳性对照应用于灭活效果验证,结果显示细胞感染法及免疫荧光法的检测结果较为一致。结论建立了EV-A71病毒感染性滴度检测用参考品(EV-A71病毒参考品),12个月内储存稳定性良好,可用于EV-A71灭活疫苗生产工艺中病毒滴度评价和控制,以及作为灭活效果验证中的阳性对照,从而为单价或多价肠道病毒灭活疫苗的研究提供理论依据。