重组变构人TRAIL联合柔红霉素对白血病细胞诱导凋亡作用及其机制的研究

为了研究重组变构人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(recombinanat mutant human TRAIL,rmhTRAIL)单用及与柔红霉素(DNR)联合应用对白血病细胞株U937、K562的诱导凋亡作用及其机制,以正常人胚肺成纤维细胞株MRC-5作对照,采用MTT法检测体外培养的U937、K562白血病细胞株在rmhTRAIL单用和联合DNR作用下增殖的抑制效应;用半定量逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)法检测DNR处理前后白血病细胞TRAIL死亡受体和诱杀受体的mRNA表达水平。结果表明rmhTRAIL对白血病细胞株U937、K562有较明显的抑制增殖作用,DNR与TRAIL联合对抑制肿瘤细胞具有协同性,与各药单独使用比较均有显著差异(P<0.05);经DNR作用后,U937、K562细胞的死亡受体DR4、DR5水平上调,而两种诱杀受体DcR1、DcR2表达未受影响。结论在体外rm-hTRAIL单用或与DNR联用均能明显抑制白血病细胞增殖,rmhTRAIL与DNR对白血病细胞的杀伤有协同作用,其诱导机制可能与U937、K562细胞死亡受体DR4、DR5表达水平上调有关。

重组变构人TNF相关促凋亡配体联合三氧化二砷诱导白血病耐药细胞株凋亡

本研究探讨重组变构人TNF相关促凋亡配体(recombinant mutant human TNF-related apoptosis-inducing ligand,rmhTRAIL)联合三氧化二砷(As2O3)对阿霉素诱导的人慢性髓系白血病红白血病变耐药细胞株K562/AO2(mdr-1+)的促凋亡作用。以亲本阿霉素敏感细胞株K562(mdr-1-)为对照,观察rmhTRAIL作用后细胞形态变化,采用MTT法测定rmhTRAIL、As2O3单药及联合作用后细胞增殖抑制率;碘化丙锭染色的流式细胞术(FACSCalibur)定量检测rmhTRAILL、As2O3单药及联合作用后sub-G1峰占检测细胞的百分比(sub-G1%)。结果表明:rmhTRAIL联合As2O3对K562/AO2和K562增殖的抑制作用优于单药,采用国内金(正均)氏公式判断rmhTRAIL和As2O3联合作用具有协同作用;流式细胞术定量检测sub-G1%显示,rmhTRAIL2 000ng/ml与As2O32μmol/L单独作用下K562/AO2组与K562组凋亡率分别为(34.93±0.10)%、(10.53±0.16)%(p<0.01);(5.95±0.07)%、(3.50±0.01)%(p<0.05),联合作用下细胞凋亡率分别为(50.95±0.91)%、(20.75±0.95)%(p<0.05),K562/AO2组凋亡效应强于K562组。结论:rmhTRAIL可诱导K562、K562/AO2细胞凋亡;rmhTRAIL联合凋亡诱导剂As2O3对白血病耐药细胞株K562/AO2和K562细胞株的凋亡具有协同作用;rmhTRAIL、As2O3对K562/AO2的促凋亡作用优于其亲本K562细胞。

rmhTRAIL诱导耐阿霉素细胞株K562/A02凋亡及作用机制的实验研究

目的:探讨recombinanat mutant human TNF-related apoptosis -inducing ligand,(rmhTRAIL)对阿霉素诱导的人慢性粒细胞白血病红白血病变耐药细胞株K562/A02(mdr-1+)的促凋亡作用及其机理。方法:以亲本阿霉素敏感细胞株K562(mdr-1-)为对照,观察rmhTRAIL作用后K562、K562/A02细胞形态变化,采用碘化丙啶染色法流式细胞术(FACSCalibur)定量检测细胞sub -G1%, MTT法测定rmhTRAIL对细胞增殖抑制,半定量逆转录-聚合酶链反应(semiquantitative reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)方法检测K562、K562/A02细胞的四种TRAIL受体DcR1、DcR2、DR4、DR5mRNA表达水平。结果:rmhTRAIL可诱导K562、K562/A02细胞凋亡,有典型的细胞形态改变;流式细胞术检测显示K562/A02的sub -G1%大于K562 (P<0.05); rmhTRAIL对K562/A02的增殖抑制作用优于K562 (P<0.05); K562/A02中DR4、DR5mRNA的表达高于K562, DcR1mRNA在K562/A02表达低于K562, DcR2 mRNA在两种细胞中均不表达。结论:rmhTRAIL可以诱导K562/A02细胞凋亡;rmhTRAIL对K562/A02促凋亡和抑制增殖作用优于其亲本细胞K562;K562/A02细胞表面TRAIL死亡受体高表达及诱骗受体低表达可能是耐药细胞更敏感的原因。

重组变构人TRAIL对非小细胞肺癌细胞的体外抑制作用

目的研究重组变构人TRAIL(rmhTRAIL)对人非小细胞肺癌(NSCLC)细胞和人正常细胞的生长、抑制作用及其与化疗药的联合作用。方法采用四唑盐(MTT)和集落形成试验法检测细胞的生长,并观察了与顺铂(DDP)联合应用对细胞生长的作用。结果rmhTRAIL对多种NSCLC细胞有显著的抑制作用,而对人正常细胞无影响;rmhTRAIL与DDP联合应用具有协同或增强对NSCLC细胞的抑制作用,而且对正常人细胞不表现毒性。结论rmhTRAIL是一种安全、有效的抗肿瘤生物制品。

重组人淋巴毒素α的高密度发酵、复性和纯化

目的建立和优化重组人淋巴毒素α(rhLT-α)工程菌高密度发酵方法以及目的蛋白的复性和纯化方法,得到高纯度的重组人淋巴毒素α。方法高密度发酵rhLT-α工程菌,超声破碎细胞提取包涵体,经过复性后,用DEAE Sepharose FF,Phenyl Sepharose FF(LS)进行分离纯化。结果重组人淋巴毒素α以包涵体形式表达,经过破碎离心收集包涵体,洗涤后包涵体纯度达到85%以上。复性后,经两步纯化,最终目的蛋白纯度达98%以上。活性达6×108U/mg以上。结论建立了高效简便的淋巴毒素生产工艺,为淋巴毒素的规模生产打下了基础。

重组变构人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体与吉西他滨联合对人非小细胞肺癌细胞株NCI-H460的体内外抑制作用

目的观察重组变构人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（rmhTRAIL）与吉西他滨（GEM）联合应用对人非小细胞肺癌细胞株NCI-H460在体内外的抑制作用。方法采用二苯基溴化四氮唑蓝（MTT）法，检测系列浓度的rmhTRAIL和GEM单独或联合应用时对人肺癌NCI-H460细胞生长的抑制作用。将NCI-H460细胞裸鼠移植瘤模型分为6组：对照组（腹腔注射生理盐水）、rmhTRAIL组、GEM组、rmhTRAIL＋GEM组、GEM＋顺铂（DDP）组和rmhTRAIL＋GEM＋DDP组，分别给药。每3～4d测量1次裸鼠移植瘤大小，用药后21d，处死裸鼠，剥取肿瘤称重。结果rmhTRAIL和GEM单独或联合应用时对NCI-H460细胞的生长抑制作用呈剂量依赖性，且系列浓度的rmhTRAIL和GEM的联合具有协同抑制作用。rmhTRAIL组、rmhTRML＋GEM组、GEM＋DDP组和rmhTRAIL＋GEM＋DDP组的相对肿瘤体积分别为4．75±3．04、2．53±1．25、4．52±2．87和1．69±0．97，均显著低于对照组（8．82±5．62，均P〈0．05）；肿瘤重量分别为（2．23±0．29）g、（1．12±0．77）g、（2．51±0．87）g和（0．60±0．18）g，均显著低于对照组[（4．71±0．97）g，均P〈0．01]。rmhTRAIL＋GEM组的相对肿瘤体积和肿瘤重量均显著低于rmhTRAIL组和GEM组（P〈0．05和P〈0．01）。rmhTRAIL＋GEM＋DDP组的相对肿瘤体积和肿瘤重量均显著低于rmhTRAIL组和GEM＋DDP组（P〈0．05和P〈0．01）。结论在体内外实验中，rmhTRAIL与吉西他滨联合对人肺癌细胞株NCI-H460的生长均显示出协同抑制作用。

人乳头瘤病毒（HPV）L2肽免疫小鼠诱导的抗体水平与保护作用的关系研究

目的 检测HPV-58 L2 11～200 AA肽在动物体内对HPV的保护效果,并分析疫苗诱导的抗体滴度或中和抗体滴度与疫苗保护作用之间的对应关系.方法 利用大肠杆菌表达HPV-58L2 11～200 AA肽,纯化目的 蛋白并与铝佐剂吸附后免疫小鼠,利用小鼠HPV-58假病毒感染模型检测不同剂量的免疫原对小鼠的保护作用.通过ELISA和假病毒中和抗体检测方法 检测免疫血清中的总抗体水平和中和抗体水平,分析具有保护作用的抗体或中和抗体滴度.结果 当蛋白免疫剂量为8μg时,能够完全保护小鼠不受HPV假病毒的感染.小鼠免疫血清中的中和抗体水平较低,利用已建立的假病毒中和试验方法 检测不到血清中的中和抗体.而利用ELISA检测血清中的总抗体水平结果 显示,免疫血清中的总抗体水平与疫苗的保护效果之间存在对应关系,当抗体滴度大于等于1：25 000时,小鼠体内检测不到荧光信号,能够保护机体不受假病毒的感染.结论 HPV-58 L2 11～200 AA肽能够保护小鼠不受假病毒的感染,L2 11～200 AA肽具有较好的疫苗发展前景,其引发的总抗体水平可以作为评价保护效果的间接指标.

质子泵抑制剂对儿童哮喘的治疗并无益处

近来多有报道，患有哮喘的儿童常常具有反流性食管炎（GER）的症状。既往非随机非盲法的临床研究结果显示，质子泵抑制剂（PPI）治疗可使患有哮喘和GER儿童的哮喘症状得到缓解。但关于GER是否是引起顽固性哮喘的原因之一，尚无定论。

重组变构人肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体对裸鼠移植非小细胞肺癌的治疗作用

目的观察新研制的重组变构人肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TRAIL)(recombinantmutanthumanTRAIL,rmhTRAIL)的抗肿瘤作用进行评价。方法采用非小细胞肺癌NCI-H460裸鼠异种移植瘤模型,观察腹腔注射不同剂量(共分5组)的rmhTRAIL对裸鼠肿瘤生长抑制的作用。此外,用TUNEL染色法及DNA片段的凝胶电泳法观察了rmhTRAIL在体内外对裸鼠肿瘤细胞的诱导凋亡作用。结果rmhTRAIL中(5mg/kg)、高剂量(15mg/kg)组相对肿瘤体积(RTV)分别为3.19±2.05和1.47±0.77,显著小于对照组8.48±5.87(P<0.05,和P<0.01);相对肿瘤增值率(T/C%)分别为37.6%和17.3%。中、高剂量组肿瘤重量分别为1.09g±0.55g和0.31g±0.09g,显著小于对照组2.78g±0.77g(P<0.01)。经rmhTRAIL处理的肿瘤组织和体外培养的肿瘤细胞均出现大量TUNEL染色阳性的凋亡细胞,rmhTRAIL处理的肿瘤细胞的DNA提取物在琼脂糖凝胶电泳上呈现典型的具有凋亡特征的DNA梯带。结论rmhTRAIL具有显著的体内外抗肿瘤作用,其机制主要是引起肿瘤细胞的凋亡。