重组腺相关病毒装载目的核酸完整性分析

目的探讨重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus,rAAV)装载目的核酸完整性检测方法,并初步建立分析算法。方法消化rAAV外游离DNA片段,提取病毒基因组,设计5对搭接引物,采用正交排列方式,分别用数字PCR仪进行检测,常规条件采用EveGreen和模板4μL的20μL反应体系,数字PCR条件:95℃5 min;95℃15 s,55℃30 s,72℃90 s,45个循环。超长核酸片段增强条件采用Mix B-2000 bp和模板2μL的25μL反应体系,采用仪器附带软件定量。最小二乘法拟合分析共有的全长片段数量,进而解读目的核酸完整性分布情况。结果引物间距离不大于1200 nt的片段可得到有效扩增,经系统分析得到一系列片段长约1000 nt的有效片段拷贝数,最小二乘法拟合分析共有片段拷贝数量,估计样本中全长片段不多于1234 copies/μL,该值与测得的最大值(1443 copies/μL)之间差异有统计学意义(P<0.05),差异占比约16.9%。结论初步建立了rAAV装载目的核酸完整性的检测方法,并分析出供试品中存在一定数量的不完整目的核酸,为后续深入研究奠定了基础。