巨细胞病毒gp52蛋白表达与应用

目的构建表达巨细胞病毒(CMV)gp52蛋白抗原的重组质粒及工程菌,获取纯化的gp52蛋白抗原。方法采用PCR技术,克隆表达CMVgp52重组蛋白,利用产物建立IgM捕获ELISA方法鉴定其抗原性及实用性。结果表达纯化的gp52蛋白纯度>95%,经酶标记建立IgM捕获ELISA方法,检测35份抗巨细胞病毒IgM阳性血清和35份阴性血清,用酶标记gp52蛋白建立的捕获ELISA法阳性检出率97.1%,阴性检出率100%,与意大利SORIN公司试剂盒检测结果比较,差异无统计学意义(P>0.05);其中1份CMV-IgM阳性血清1:16稀释后仍能与抗原反应,表明gp52蛋白抗原表位有较好的抗原特异性。结论高效表达纯化的gp52蛋白抗原性强,利用其建立的IgM捕获ELISA方法,可用于检测巨细胞病毒抗体。

风疹病毒E1蛋白克隆表达及应用

目的构建表达风疹病毒蛋白抗原的重组质粒及工程菌,获得纯化的E1蛋白抗原,用于检测风疹病毒特异性抗体IgM。方法克隆表达风疹病毒E1重组蛋白,利用产物建立IgM捕获ELISA方法鉴定其抗原性及实用性。结果表达纯化的E1蛋白经酶标记建立IgM捕获ELISA方法,检测53份抗风疹病毒IgM阳性血清和67份阴性血清,用酶标记E1蛋白建立的捕获ELISA法阳性检出率98.1%,阴性检出率100%,与意大利SORIN公司试剂盒检测结果比较,无统计学意义(P>0.05);其中1份风疹病毒(IgM)阳性血清1∶16稀释后仍能与抗原反应,初步表明E1蛋白抗原表位有较好的抗原特异性。结论高效表达纯化的E1蛋白抗原性强,利用其建立的IgM捕获ELISA方法,可用于检测风疹病毒抗体。

聚合酶链反应检测丁型肝炎病毒方法的建立及初步应用

目的:研究建立聚合酶链反应(PCR)检测丁型肝炎病毒的方法,并在临床上作初步应用。方法:选择HDV保守区域基因片段设计合成特异性引物,建立检测HDV感染的PCR方法,对450例门诊患者血清进行HDV感染检测。结果:该PCR方法特异性和灵敏度均较高,450例门诊患者血清HDV感染率为1.3%,与ELISA法比较,总符合率为99.3%。结论:本PCR方法可用于检测HDV感染,是一种快速、简便、实用的方法。

TT病毒DNA PCR-ELISA检测方法的建立

目的:建立检测TT病毒(TTV)DNA快速、敏感、特异的PCR-ELISA方法。方法:将生物素标记的PCR产物与地高辛标记的特异性探针杂交。通过酶免疫显色反应测出A值,判断TTV感染情况。优化反应条件,与PCR电泳结果比较,测定方法的敏感性,并检测325份正常人群、甲～庚型肝炎、非甲～庚型肝炎血清标本,确定该方法的特异性。结果:本实验的最佳杂交时间为45min,最佳探针浓度为4pmol/mL。该方法的检测阈值为50fg/μL TTV DNA,其灵敏度是PCR电泳法的10倍,检测TTV在正常人群、甲～庚型肝炎、非甲～庚型肝炎血清标本中的阳性率分别为2.4%、29.3%、25.0%,与PCR电泳检出结果差异无显著性(P>0.05)。结论:PCR-ELISA是一种快速、敏感、特异的检测方法,可用于临床TTV感染的诊断。

重组人肠激酶轻链的原核表达、纯化及活性分析

【目的】在原核表达系统中实现人肠激酶轻链(Human enterokinase light chain,hEKL)的表达和纯化。【方法】通过PCR扩增得到编码hEKL的基因片段,利用基因重组技术构建原核表达质粒pMAL-s-hEKL,在Escherichia coli中进行诱导表达,菌体经超声破碎后利用Amylose亲和柱对目标蛋白进行纯化,并利用Tricine SDS-PAGE检测酶的切割活性。【结果】目的基因能够以可溶形式表达,每升发酵液可纯化得到40 mg纯度在97%以上的MBP-hEKL蛋白,活性检测表明该酶可以对含有肠激酶识别序列的蛋白进行特异性切割,酶活力达到6.0×105U/mol。