吸附无细胞百(三组分)白破联合疫苗内毒素定量检测方法的建立及验证

目的建立吸附无细胞百日咳(三组分)-白喉-破伤风联合疫苗﹝diphtheria, tetanus and acellular pertussis (three components) combined vaccine, adsorbed, DTacP﹞内毒素含量的定量检测方法, 并对其进行验证。方法采用动态显色法(美洲鲎试剂)检测DTacP的内毒素含量, 并对该方法的线性与范围、专属性、准确度、中间精密度、重复性、定量限进行验证, 并与凝胶法结果进行比较。结果动态显色法的线性相关系数的绝对值大于0.99;DTacP稀释100倍和1 000倍, 对试验均无干扰作用;3批DTacP内毒素检测结果的准确度回收率分别为56%、75%、80%, 重复性的变异系数分别为5.59%、7.14%、5.81%;不同操作人员在不同时间检测3批DTacP中内毒素结果的变异系数分别为15.93%、8.48%和7.43%;将光密度反应阈值30毫吸光度单位增减3毫吸光度单位, 耐用性的相对偏差均小于15%。DTacP中内毒素含量检测的定量限为30内毒素单位(endotoxin unit, EU)/ml。动态显色法检测3批DTacP中内毒素含量的检测结果与凝胶法结果一致, 均小于限定值200 EU/ml。结论建立了定量检测DTacP中内毒素含量的动态显色法, 该法具有良好的线性、专属性、准确度、中间精密度以及重复性, 可用于DTacP中内毒素含量的定量检测。

百日咳毒素、丝状血凝素和百日咳黏附素精制抗原纯度的SDS-PAGE检测方法的验证

目的采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)方法检测百日咳毒素(pertussis toxin,PT)、丝状血凝素(filamentous hemagglutinin,FHA)和百日咳黏附素(pertactin,PRN)精制抗原纯度,并进行验证。方法对样品进行SDS-PAGE电泳、考马斯亮蓝染色后,使用凝胶成像系统拍照并用Image Lab软件进行分析,获得样品各蛋白条带的光密度值。对建立的方法进行系统适用性、线性、准确度、重复性、中间精密度、灵敏度和耐用性验证。结果对应2套分子量标准蛋白,PT、FHA和PRN精制抗原分别在10.00~50.00μg/mL的低质量浓度范围和50.00~600.00μg/mL的高质量浓度范围内,蛋白浓度和对应条带光密度值之间具有良好的线性关系,相关系数(coefficient of correlation,r)≥0.99。3种精制抗原杂质水平准确度和重复性回收率均在80%~120%,且重复性验证相对标准差(relative standard deviation,RSD)≤10%;抗原水平准确度和重复性回收率均在90%~110%,重复性验证RSD≤10%;灵敏度12.50μg/mL的回收率均在80%~120%,RSD≤10%;中间精密度验证RSD≤10%。结论建立的测定PT、FHA和PRN精制抗原纯度的SDS-PAGE法,其系统适用性、准确度、重复性、中间精密度和灵敏度均良好,可用于以上精制抗原的纯度检测。