壳聚糖及其衍生物纳米粒的制备以及在疫苗中的应用研究

壳聚糖是一种高分子线性阳离子多糖.由壳聚糖及其化学改性衍生物制备的纳米粒具有生物相容性好、细胞毒性低以及可降解等特点,人们对其作为佐剂或递送系统在疫苗中的应用已开展了广泛研究.此文对壳聚糖及其衍生物纳米粒的制备方法以及在疫苗中的应用进行综述.

脑心肌炎病毒实验性疫苗免疫原性初步研究

目的：制备脑心肌炎病毒（ EMCV）实验性疫苗并对其免疫原性进行初步研究。方法采用Vero细胞培养EMCV病毒，微量细胞病变法检测病毒滴度；经过浓缩、过滤、超速离心等方法初步纯化EMCV；摸索病毒灭活方法；确定病毒半数致死量（ LD50）；通过肌肉注射途径免疫小鼠，微量中和试验测定血清中和抗体效价；免疫后小鼠分别以100LD50、50LD50和25LD50进行腹腔攻毒试验。结果以1∶4000β-丙内酯4℃放置12 h作为病毒灭活条件，病毒半数致死量17 CCID50/ml；免疫小鼠能检测到中和抗体并对病毒攻击具有抵抗力。结论 EMCV实验性疫苗能诱导小鼠产生保护性抗体。

脑心肌炎病毒鉴定方法的初步研究

目的摸索建立脑心肌炎病毒（EMCV）鉴定方法。方法根据GenBank中EMCVVR．129B序列设计引物，提取病毒RNA，进行RT．PCR，琼脂糖凝胶电泳检测片段大小。将DNA测序结果与GenBank中相同毒株EMCV序列进行比对。以RK细胞培养的全病毒作为免疫原制备抗血清，用于建立间接免疫荧光试验（IIFA）及中和试验方法，并验证方法精密性和特异性。制备抗GST—VPl和抗GST．VP2多克隆抗体，与EMCV浓缩液进行免疫印迹反应。结果获得的DNA片段与GenBank中上传的相同毒株EMCV序列进行比对，相似性为98％-100％。采用20100901批抗血清160倍稀释作为一抗，建立IIFA方法，特异性好。检测20100901批抗血清中和效价1：30211，建立的固定病毒．稀释血清中和试验方法特异性、精密性好。抗GST—VPl和GST—VP2抗体与EMCV浓缩液于相对分子质量为33x103左右分别出现清晰单一条带，与理论值相符。结论初步建立了用于EMCV毒株鉴定的RT-PCR、间接免疫荧光、中和试验及免疫印迹方法。

抗抑制性受体单克隆抗体药物研究进展

在近20年,针对程序性死亡分子1和细胞毒性T细胞相关抗原4等抑制性受体的抗体药物一直是研究热点.抑制性受体通路（免疫检查点）在正常情况下维持免疫内稳态,防止免疫细胞过度激活,但肿瘤可以通过抑制性受体通路来逃避免疫细胞杀伤.抗体药物可阻断抑制性信号通路,进而活化免疫细胞杀伤肿瘤细胞.此文对抗抑制性受体抗体药物的最新进展进行综述.

病毒相关碳水化合物的研究进展

碳水化合物的作用已经超过了传统意义上的能量来源和结构聚合物，相关研究不再局限于细菌类疫苗。随着糖化学和免疫学的快速发展，碳水化合物的研究推动了抗肿瘤、抗寄生虫、抗病毒等疫苗及药物的研发。此文仅对基于碳水化合物的研究在抗病毒如人类免疫缺陷病毒、流感病毒、丙型肝炎病毒、冠状病毒方面的进展进行综述。

以血管内皮生长因子及其受体为靶点的肿瘤疫苗研究进展

肿瘤的生长、侵袭和迁移依赖于血管新生。因此，以抑制肿瘤血管形成为目标的抗肿瘤治疗策略是当前研究的热点。血管内皮生长因子及其受体在肿瘤血管新生这一病理性血管形成过程中起关键作用，从而使它们成为研发肿瘤疫苗的靶点。此文就疫苗的研发基础、免疫机制及研究进展做一综述。

痘病毒载体艾滋病疫苗研究进展

艾滋病是一种传染性强、传播速度快、传播范围广、病死率高的传染病。抗逆转录病毒药物可以抑制感染者体内病毒的复制，但不能将其完全清除。研究显示，以痘病毒为载体，经过局部基因修饰后研制的预防性艾滋病疫苗具有较好安全性和一定免疫原性。此文对痘病毒载体艾滋病疫苗的研究进展进行综述。

黏膜佐剂及递送系统研究进展

通过黏膜途径接种疫苗成为近年来的研究热点。黏膜疫苗具有诱导局部和全身免疫应答和依从性好等诸多优点。但大多数抗原经黏膜接种时易引起免疫耐受，阻碍了黏膜疫苗的进一步研发。为了克服这些困难，人们设计了大量的黏膜免疫佐剂和抗原递送系统以增强机体对抗原的黏膜和全身免疫应答。此文介绍了主要的黏膜佐剂和递送系统的研究进展。

鼻内接种型乙型肝炎疫苗递送系统和免疫增强剂的研究进展

目前乙型肝炎疫苗通过肌肉注射方式接种,虽然具有很好的乙型肝炎预防效果,但依从性差.而鼻内接种生物利用度高,依从性好,被认为是替代注射接种最可行的途径.此文对鼻内接种型乙型肝炎疫苗的递送系统和免疫增强剂的研究进展做一综述.

肿瘤基因标志物的应用和研究进展

肿瘤基因标志物是指肿瘤组织或细胞中发生突变或者表达异常的一类基因,涉及基因组学和表观遗传学相关分子.当前,利用分子生物学技术筛选各类肿瘤基因标志物,对于辅助肿瘤早期诊断、预后判断、个体化治疗具有重要意义.此文从DNA和RNA肿瘤标志物方面,阐述近年来肿瘤基因标志物在肿瘤诊断和治疗中的应用和研究进展.

抗肿瘤重组蛋白疫苗的研究进展

肿瘤疫苗包括肽或蛋白疫苗、肿瘤细胞疫苗、抗独特型疫苗、树突状细胞疫苗、DNA疫苗及病毒载体类疫苗等.重组蛋白疫苗是通过对目的抗原基因的重组、构建、表达得到抗原蛋白,最终制备成的疫苗.随着重组技术及表达纯化技术的日益成熟,重组蛋白疫苗为肿瘤免疫治疗研究提供了一种研发思路.此文针对肿瘤抗原的重组蛋白疫苗做一综述.

壳聚糖衍生物在口鼻黏膜疫苗中的应用

壳聚糖是一种有效的黏膜疫苗佐剂和递送载体，但因其水溶性差，应用受到一定限制。通过对壳聚糖进行不同的化学修饰可得到各类壳聚糖衍生物，这些衍生物不仅溶解性较好，而且保持了壳聚糖良好的生物相容性、生物降解性、免疫刺激活性等优势，为黏膜疫苗，尤其是经口、鼻途径递送的疫苗提供了新型候选佐剂和递送载体。此文对修饰壳聚糖的主要方法以及其衍生物在口鼻黏膜疫苗中的应用做一综述。

抗人肿瘤坏死因子-α人源单克隆抗体在CHO细胞中的表达及鉴定

目的在CHO细胞中表达抗人肿瘤坏死因子(human tumor necrosis factor-alpha,h TNF-α)人源单克隆抗体,并对抗体纯化后进行鉴定。方法将含有编码抗h TNF-α人源单克隆抗体轻、重链可变区及恒定区基因的真核表达质粒p HL,利用脂质体Lipofectamine TM 2000转染CHODG44细胞,经氨甲喋呤(methotrexate,MTX)加压筛选和单克隆筛选,获得分泌表达抗h TNF-α人源单克隆抗体的CHO细胞株。应用Mab Select Su Re和Capto adhere两步层析纯化抗体后,分析抗体的纯度、N-末端序列、结合动力学平衡常数及中和活性。结果经两步层析后,抗h TNF-α人源单抗经SDS-PAGE分析,可见纯度较好的抗体重链、轻链和完整抗体条带,SEC-HPLC纯度为98.79%;抗体的轻、重链N-末端氨基酸序列与预期一致,其结合动力学平衡常数(KD)为1.34×10-10 M,能拮抗TNF-α对L929细胞的杀伤作用,对TNF-α细胞毒的中和率达90%左右。结论在CHO细胞中成功表达了具有较好中和活性的抗h TNF-α人源单克隆抗体。

重组乙型肝炎病毒核心抗原的免疫原性及其对乙型肝炎病毒表面抗原的免疫增强作用

目的探讨重组乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)的免疫原性及其对重组乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)的免疫增强作用。方法用透射电镜观察HBcAg、HBsAg及HBcAg+HBsAg混合抗原病毒样颗粒(Virus-like particle,VLP)的形态。将小鼠随机分为6组:阴性对照组(NS)、HBcAg组(C)、HBsAg组(S)、HBsAg+铝佐剂组(S+Al)、HBsAg+HBcAg混合组(S+C)及HBsAg+HBcAg+铝佐剂组(S+C+Al),用相应抗原免疫各组小鼠,分别于第0天、第14天经小鼠双侧大腿肌肉进行初次和加强免疫1次,间接ELISA法检测各组小鼠血清中HBsAg和HBcAg的特异性抗体水平,分析HBsAg特异性抗体亚类,ELISPOT法检测各组小鼠脾细胞中HBsAg特异性IFNγ、HBcAg特异性IFNγ及HBsAg特异性IL-4水平。结果电镜观察可见HBsAg和HBcAg均呈大小均一的VLP结构,二者混合后有聚集现象。初次免疫后,S+C组的HBsAg特异性抗体水平与S组差异无统计学意义(P=0.074),加强免疫后,S+C组HBsAg特异性抗体水平明显高于S组(P=0.002),C组和S+C组均可产生高水平HBcAg特异性抗体。S组HBsAg抗体亚类以IgG1为主,S+C组以IgG2a为主。S+C组HBsAg特异性IFNγ斑点数明显高于S组、S+Al组和S+C+Al组(P<0.05),C组与S+C组HBcAg特异性IFNγ斑点数均较高,与S+C+Al组比较,S+Al组HBsAg特异性IL-4斑点数明显升高(P=0.026)。结论 HBcAg具有良好的免疫原性,可增强HBsAg的免疫反应,使反应向Th1方向极化,为治疗性乙肝疫苗的研发奠定了基础。

HBcAg-VEGF抗原表位融合蛋白的原核表达、纯化及其免疫原性

目的 原核表达、纯化HBcAg-VEGF抗原表位融合蛋白,并分析其免疫原性。方法 生物信息学方法预测鼠血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）的B细胞抗原表位,采用重叠延伸PCR（splicing by overlap extension PCR,SOE-PCR）法将VEGF抗原表位基因插入到HBcAg基因的免疫优势区内,合成HBcAg-VEGF基因序列,克隆至原核表达载体pET-32a中,构建重组表达质粒pET-32a-HBcAg-VEGF,转化大肠埃希菌BL21（DE3）,IPTG诱导表达。表达产物经羟基磷灰石CHT层析、Sephacryl S-400HR凝胶过滤层析纯化后,与Al（OH）3佐剂混合,分别于第0、7、14、21天经肌肉免疫BALB/c小鼠1次,第28天采血,ELISA法检测血清中抗VEGF抗原表位抗体,VEGF受体结合抑制试验筛选具有良好免疫原性的VEGF优势抗原表位。对筛选出的优势抗原表位融合蛋白进行表达及纯化条件的优化。结果 生物信息学软件预测了6个VEGF的B细胞抗原表位;6个重组表达质粒经菌落PCR及测序证实构建正确;表达的HBcAg-VEGF抗原表位融合蛋白相对分子质量为14400～20100,纯度均在85%以上,除HBcAg-VEGF3以单体形式存在、不形成颗粒外,其他融合蛋白均能形成VLP;各组HBcAg-VEGF融合蛋白免疫小鼠后,均刺激机体产生了针对VEGF抗原表位肽的特异性抗体,其中HBcAg-VEGF1组抗体水平最高,且抑制VEGF与VEGFR结合的能力最强;采用优化的条件表达、纯化的HBcAg-VEGF1抗原表位融合蛋白纯度达95%以上。结论 筛选得到的HBcAg-VEGF1抗原表位融合蛋白显示出较好的免疫原性,为进一步研究其抗肿瘤效应奠定了基础。

几种天然环二核苷酸作为人体佐剂作用潜力的比较

目的对几种天然环二核苷酸(cyclic dinucleotide,CDN)作为人体佐剂作用的潜力进行比较。方法以相同剂量的CDN(c-di-GMP、c-di-AMP、3′3′cGAMP和2′3′cGAMP)同人体来源的单核细胞白血病细胞(human monocytic leukaemia cells,THP-1)共孵育,同时将CDN(c-di-GMP和2′3′cGAMP)与脂质体混合后同THP-1细胞共孵育,刺激5 h后,收集细胞及培养液,采用实时定量PCR及ELISA法检测IFNβ基因及蛋白的表达水平,同时检测脂质体对不同类型CDN刺激作用的影响。结果 4种CDN均能有效刺激THP-1细胞IFNβ基因及蛋白表达水平的提高,且对人体细胞作用从强到弱依次为2′3′cGAMP、3′3′cGAMP、c-di-AMP和c-di-GMP,各自之间差异有统计学意义(P <0. 01)。脂质体能显著增强典型和非典型CDN对THP-1细胞的刺激作用,差异有统计学意义(P <0. 01)。结论 4种天然CDN对人体均具有潜在的佐剂效应,从作用强度看,2′3′cGAMP是最优选择,同时脂质体能增强CDN的这种效应,为将来进一步对CDN类化合物的佐剂作用的研究奠定基础。