疫苗用原辅料中猪源性病毒PCR检测方法的建立

猪源性病毒是一类广泛寄生于猪体内的病毒,其不只感染猪,对人和多种哺乳动物也能造成感染,并可能致病[1-2]。2015版《中国药典》要求[3],制备疫苗用的动物细胞需要检测猪源性病毒为阴性。目前生物制品中越来越多涉及到猪来源的原料或辅料,如疫苗生产中使用的胰蛋白酶和水解乳蛋白及明胶等。

Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗Vero细胞DNA残留定量PCR检测法的验证

目的验证Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗中Vero细胞DNA残留定量PCR(quantitative PCR,qPCR)检测法。方法用试剂盒提取Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗原液的DNA,采用qPCR检测Vero细胞DNA,并验证方法的线性、专属性、准确性、精密度、耐用性及定量限;同时采用DNA探针杂交法检测样品。结果qPCR检测Vero细胞DNA标准曲线在0.0030~300.0000pg/μl之间线性良好;对Hep-2细胞、大肠埃希菌、酵母细胞DNA均无扩增反应;高、中、低浓度样品加标回收率在50%~150%,准确性良好;定量检出限为0.0030pg/μl;精密度良好(相对标准偏差<15%);反应体系配制好后置于2~8℃30min后进行检测,相对标准偏差<15%,耐用性良好。DNA探针杂交法与qPCR结果均小于0.1pg/μl。结论qPCR检测Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗中Vero细胞DNA残留具有良好的线性、专属性、准确性、精密度和耐用性,可适用于该项检测。

定量检测异丙醇消毒剂含量的气相色谱法的建立与验证

目的建立一种定量检测异丙醇消毒剂含量的气相色谱法。方法采用DB-1气相色谱柱,尺寸为30 m(长)×0.53 mm(内径)×3.00 μm(膜厚)。色谱条件如下:程序升温;以氮气为载气,恒定流速5 ml/min;进样口温度为200 ℃,检测器温度为275 ℃;分流进样,进样量1 μl。对该法进行专属性、准确性、重复性、耐用性验证。结果异丙醇气体和正丁醇气体完全分离,分离度为25.4。该法在考察范围内线性良好,决定系数为0.999 977。正丁醇稀释液色谱图中没有干扰峰出现。3个浓度级异丙醇测试液的回收率为98%~101%。2名分析员分别检测同一样品的6个平行测试液,测定结果的相对标准偏差为0.5%。结论建立的方法专属性、准确性、重复性和耐用性良好,可用于异丙醇消毒剂的定量检测。

MAPREC与MNVT评价Ⅲ型Sabin株脊髓灰质炎病毒神经毒力的比较

目的用PCR扩增及限制性酶切分析突变技术(MAPREC)和猴体神经毒力试验(MNVT)评价同一批Ⅲ型Sabin株脊灰病毒神经毒力的结果差异。方法采用MAPREC技术,检测Ⅲ型Sabin株脊灰病毒神经毒力关键位点472位点突变率;采用MNVT病理切片分析,评价Ⅲ型Sabin株脊灰病毒神经毒力。结果 MAPREC检测待测样品核酸472位点突变率均值为0.324%,低于高突变参考品的0.621%。MNVT切片结果分析表明,xtest–xref=0.169,小于C1。对同一批样品,MAPREC与MNVT分析结果一致。结论在Ⅲ型Sabin株脊灰病毒神经毒力检测方面,操作简单,试验周期短的MAPREC技术可作为金标准MNVT的有益补充。

重组胰蛋白酶在鸡胚细胞消化中的初步研究

目的比较猪源胰蛋白酶与重组胰蛋白酶对鸡胚细胞的消化效果,筛选出可替代猪源胰蛋白酶消化鸡胚细胞的最优方案。方法对照组用质量百分数0.125%猪源胰蛋白酶溶液,实验组分别用质量百分数0.1%、0.2%、0.3%重组胰蛋白酶溶液按照验证参数消化鸡胚细胞15、20、25 min,进行细胞计数,并监测细胞活率。筛选出最优方案,制备单次病毒收获液,并与0.125%猪源胰蛋白酶对比滴度结果。结果对照组平均活细胞密度为1.12×10^(6)ml^(-1),平均细胞活率为95%;实验组最优鸡胚细胞消化条件为0.2%重组胰蛋白酶溶液消化20 min,平均活细胞密度为2.24×10^(6)ml^(-1),平均细胞活率为97.00%。2组消化鸡胚细胞效果差异有统计学意义,t=19.65,P<0.05。0.125%猪源胰蛋白酶组病毒滴度为(6.56±0.12)lgCCID_(50)/ml,0.2%重组胰蛋白酶组为(6.89±0.10)lgCCID_(50)/ml,t=6.78,P<0.05,病毒滴度结果差异有统计学意义。结论0.2%重组胰蛋白酶溶液消化20 min作为最优鸡胚细胞消化条件,可替代0.125%猪源胰蛋白酶溶液,为今后生产工艺分析研究及清真认证提供了数据和参考。

TaqMan荧光定量PCR检测细胞中逆转录病毒的方法验证

目的验证Taqman荧光定量PCR检测生物制品生产用细胞中逆转录病毒的方法。方法从专属性、检测限、线性、重现性、耐用性、准确性、精密度几个方面验证该方法在质量控制中的可行性。结果该方法可检测2BS细胞、Vero细胞中的逆转录病毒,检测限可达1.0×10^3 pU/μl逆转录酶。该法线性良好,决定系数>0.960。该方法重现性好。试剂经5次冻融,体系在室温放置1 h均不影响实验结果。外加标准品的回收率均高于70%,相对标准偏差<5%。结论Taqman荧光定量PCR法可用于检测用于2BS细胞和Vero细胞是否被逆转录病毒污染。

制药企业CNC区域微生物数据库的建立及微生物种群分析

目的建立制药企业CNC(controlled not classified)区域(即受控但未分级区域)微生物数据库,与洁净区微生物分布进行关联分析,实现对洁净区尤其是核心无菌操作区域的良好微生物控制,提升制药企业的无菌保障水平。方法以1个制药企业生产车间的CNC区域为研究对象,按照人员、物料进入洁净区的路线,逐个对CNC区域进行浮游菌、沉降菌、人员和环境表面微生物取样。微生物经培养、纯化后,采用16S rRNA测序法进行菌种鉴别。利用Microbiomeanalyst在线分析软件进行数据分析。结果制药企业CNC区域微生物数量和种类丰富,共收集到4080株微生物,分布在47个属内。革兰阳性菌占比达84.4%,主要为葡萄球菌属、微球菌属、微杆菌属;革兰阴性菌占比达15.6%,不动杆菌属是分布数量最大的革兰阴性菌。以Alpha多样性指数表征微生物种群丰富度,浮游菌、沉降菌的微生物种群丰富度最高,环境表面次之,人员表面微生物种群丰富度最低。人员帽兜和胸腹部微生物数量相对较少,脚底和手部微生物数量较多。人员表面微生物种类相对较少,且葡萄球菌占据绝对优势。CNC区域微生物分布与同生产车间B、C级洁净区微生物分布进行关联分析,B、C级洁净区收集到的微生物绝大部分包含在CNC区域微生物种群中。B、C级洁净区与CNC区域类似,均以葡萄球菌属、微球菌属为主。不动杆菌属在B、C级洁净区的分布比例较CNC区域有所下降。结论建立了制药企业CNC区域微生物数据库,确定了易进入洁净区的微生物种群,为洁净区的良好微生物控制提供了可靠的技术支持。

假病毒中和试验在重组脊髓灰质炎疫苗免疫原性评价和大鼠效力试验的初步应用

目的初步研究基于脊髓灰质炎假病毒的中和试验在重组脊髓灰质炎疫苗的免疫原性评价和大鼠效力试验中的适用性。方法对重组脊髓灰质炎疫苗免疫后的大鼠血清同时采用假病毒中和试验和Sabin株中和试验进行检测,分别采用Kappa检验和Spearman秩相关分析两种方法的一致性和相关性。结果针对Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型脊髓灰质炎病毒中和抗体,两种方法一致性检验的Kappa值分别为0.914、1.000、0.751;相关系数R值分别为0.833、0.927、0.859,P值均<0.001。结论两种方法的结果具有一致性,相关性较好,表明脊髓灰质炎假病毒中和试验可用于疫苗免疫原性评价和大鼠效力试验。

新型冠状病毒灭活疫苗抗原含量检测方法的建立

目的建立新型冠状病毒(新冠病毒)灭活疫苗抗原含量检测的双抗体夹心ELISA方法,并对该方法检测2家企业疫苗的适用性进行验证。方法使用羊抗S蛋白抗体作为包被抗体,兔抗S蛋白抗体作为显示抗体,建立了双抗体夹心ELISA方法,并对方法的准确度、精密度进行验证;分别使用该方法及企业自建方法对2家企业生产的各20批次疫苗产品进行检测,评价方法的一致性。结果成功建立了新冠病毒灭活疫苗抗原含量检测方法,该方法线性良好,R^(2)>0.99。方法验证结果显示,对于2家企业疫苗回收率均在80%~120%范围内,试验内与试验间CV均<10%。方法比对结果显示,该方法与企业方法检测结果比值对于A企业比值在0.83~1.22之间,平均为1.02;与B企业比值在0.91~1.07之间,平均为0.99;不同方法检测结果差异无统计学意义(P>0.05)。结论成功建立了新冠病毒灭活疫苗抗原含量检测方法,该方法的准确性与精密度良好,并且对国内2家企业生产的疫苗具有较好的适用性。

我国黄热病疫苗株(天坛株)与WHO疫苗株17D-213的安全性研究

目的研究我国黄热病疫苗株天坛株与WHO疫苗株17D-213在小鼠体内的脑内致病力。方法将同等病毒量的天坛株与17D-213株脑内注射不同年龄、不同品系的小鼠,观察并记录小鼠生存情况,分析两毒株的LD50/ml以及半数生存期。结果同等病毒量的天坛株与17D-213株对1日龄乳鼠、7~9 g小鼠、12~14 g小鼠的半数致死量(LD50)/ml均无差异,对7~9 g小鼠与12~14 g小鼠的生存趋势差异也无统计学意义。两病毒株对1日龄乳鼠的生存趋势存在一定的统计学差异,但是天坛株的半数生存期为11 d,WHO疫苗株17D-213为6 d。同等病毒量的两毒株,对BALB/c、KM、ICR、C57四个品系小鼠的LD50/ml也均无差异,仅对NIH小鼠表现出有一定的差异。结论我国黄热病疫苗株天坛株与WHO疫苗株17D-213对不同年龄、不同品系小鼠的脑内致病力无明显差异,安全性良好。

A群脑膜炎球菌多糖疫苗中磷含量测定的中国药典方法与欧洲药典方法的比较

目的比较检测A群脑膜炎球菌多糖疫苗中磷含量的中国药典(2015年版)方法(方法1)与欧洲药典(8.0版)方法(方法2)的差异,为今后的方法选择及进一步优化提供参考。方法分别用方法1和方法2检测标准磷溶液和A群脑膜炎球菌多糖疫苗中的磷含量,比较这2种方法的标准曲线、定量限、准确度、精密度、耐用性(溶液稳定性)的差异。结果方法1和方法2标准曲线的决定系数均值分别为0.997 3和0.999 3,定量限分别为3.97和2.16 μg。检测同一批A群脑膜炎球菌多糖疫苗显示,磷含量检测结果的相对标准偏差,方法1和方法2分别为10.3%和7.6%;磷加样回收率,方法1为87.8%~113.1%,方法2为97.1~103.6%。分别将反应溶液放置0、30、60 min后开始比色,方法1和方法2每30 min吸光度升高均值分别为0.059和0.003。结论 2种方法均可用于A群脑膜炎球菌多糖疫苗中磷含量的检测。与方法1相比,方法2的标准曲线线性更佳、检测定量限更低、准确度和精密度更高、耐用性(溶液稳定性)更好。

黄热病减毒疫苗单一收获液无菌检查超限度结果的调查分析

目的 鉴定黄热病减毒疫苗单一收获液无菌检查的阳性样品,对无菌检查超限度(out of specification,OOS)结果进行溯源分析,建立OOS调查的操作规程。方法 采用直接接种法对6瓶黄热病疫苗收获液进行无菌检查,发现1例阳性。分离纯化阳性样品得到污染物,用革兰染色法和全自动细菌鉴定仪进行鉴定。参照现行的药品质量管理规定中的OOS调查方法,分析可能引入微生物污染的相关因素。结果 第3天起,S6样品在不同培养基中均出现浑浊。阳性样品中污染物鉴定为革兰阳性粪肠球菌。OOS调查结果表明检出菌并非实验室检查过程带来的污染。结论 初步建立了无菌检查OOS的分析方案。

甲醛溶液对Sabin株脊髓灰质炎病毒灭活效果研究

目的验证4%甲醛溶液使Sabin株Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型脊髓灰质炎(脊灰)病毒达到预期灭活效果所需要的时间。方法用4%甲醛溶液对15批Sabin株Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型脊灰病毒在(36.5±1.0)℃环境进行灭活,同时以15批未加入4%甲醛溶液的病毒纯化液作为对照组,按照企业注册标准采用微量细胞病变法测定病毒滴度。为了消除4%甲醛溶液对Hep-2细胞的影响,取4%甲醛溶液接种Hep-2细胞作为实验组,同时设置Hep-2细胞为对照组,每天观察对比两组细胞形态。对同一个Hep-2细胞悬液的总细胞数和活细胞数采用传统手工计数和全自动细胞计数仪计数,并比较分析结果。结果实验组随着灭活时间的延长病毒滴度呈下降趋势,灭活第4天起,3个型别样品均检测不到病毒滴度;对照组病毒滴度在每毫升9.1~10.6 lg半数细胞培养物感染量范围内,符合企业注册标准的要求。4%甲醛溶液对Hep-2细胞生长有抑制作用,在培养观察到第3天时细胞全部失去活力死亡;对照组细胞形态良好呈多边形长成致密单层,活细胞组t值为18.098,总细胞组t值为4.005,P值均<0.05,差异有统计学意义。结论脊髓灰质炎病毒在第4天能被彻底灭活,在进行此实验时应先消除甲醛对细胞培养的影响,避免结果出现假病变现象,确保结果的准确性;应用全自动细胞计数能提高计数结果的精确度。

麻疹风疹联合减毒活疫苗的稳定性观察

目的观察麻疹风疹联合减毒活疫苗(麻风二联)的稳定性。方法将17批北京生物制品研究所有限责任公司(北京公司)2012—2017年生产的麻风二联存放于(5±3)℃,分别在0、9、12、18和24个月按照企业注册标准和中国药典2010或2015年版三部要求进行相关检测。同时对新、旧车间生产的各3批疫苗进行主要质量指标比对。结果随着存放时间延长,疫苗的病毒滴度呈逐渐下降趋势,麻疹病毒滴度波动于3.9~4.8 lg半数细胞培养感染量(CCID50)/ml,风疹病毒滴度波动于4.0~4.8 lgCCID50/ml,热稳定病毒滴度下降均不超过1.0 lg,疫苗水分不高于3.0%,疫苗的其余各项指标均符合企业注册标准和中国药典要求。新、旧车间生产的疫苗质量没有差别。结论北京公司生产的麻风二联的质量稳定。

口服Ⅰ型Ⅲ型脊髓灰质炎减毒活疫苗(人二倍体细胞)的稳定性观察

目的评价口服Ⅰ型Ⅲ型脊髓灰质炎减毒活疫苗(人二倍体细胞)的稳定性.方法将3批疫苗直立和倒立分别于-20℃以下存放30个月、(5±3)℃存放15个月、开瓶后(5±3)℃(直立)存放28 d、(25±2)℃存放5周、(37±2)℃存放5 d,另外将疫苗冻融7次,检测病毒滴度及其他疫苗稳定性主要指标.结果疫苗于-20℃以下存放30个月、(5±3)℃存放15个月、开瓶后(5±3)℃存放28 d、(25±2)℃存放4周、(37±2)℃存放4 d,以及冻融6次,总病毒滴度≥每0.1毫升6.18 lg半数细胞培养感染量(50%cell culture infective dose,CCID50)、Ⅰ型病毒滴度≥6.0 lgCCID50/0.1 ml、Ⅲ型病毒滴度≥5.6 lgCCID50/0.1 ml,均符合标准要求(总病毒和Ⅰ、Ⅲ型病毒滴度应分别不低于6.12、6.0、5.5 lgCCID50/0.1 ml).疫苗于(37±2)℃放置2 d的热稳定性试验显示,病毒滴度下降≤0.50 lgCCID50/0.1 ml,符合标准要求(不高于0.50 lgCCID50/0.1 ml).其他各项稳定性指标检查也均合格.结论口服Ⅰ型Ⅲ型脊髓灰质炎减毒活疫苗在本研究条件下稳定性良好.

器具清洁确认中铝残留量电感耦合等离子体质谱仪检测方法的建立与验证

目的建立和验证分装车间灌装器具清洁确认中铝残留量的电感耦合等离子体质谱仪(inductive coupled plasma emission spectrometer,ICP)检测法。方法对分装车间玻璃、不锈钢、陶瓷材质器具清洁后,采用擦拭法取样,ICP检测法仪器的参数确定为分析波谱396.152 nm,等离子体射频功率1150 W,载气流速0.5 L/min,蠕动泵转速50 r/min,观察模式Axial,数据采集3次。检测该方法的系统适应性,并验证方法的线性、定量限、特异性、拭子回收率、准确度、重复性、中间精密度及耐用性。结果该方法铝元素标准品标准曲线的线性良好,线性决定系数为0.9998。对该方法检测的定量限(5%目标浓度,铝元素标准品1.40μg/ml)进行6次检测,相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)为0.3%。该方法的特异性空白材质擦拭溶液响应值为玻璃-125、不锈钢-138、陶瓷-138,均小于5%目标浓度响应值27852。该方法的6个拭子回收率分别为101.26%、100.34%、100.57%、100.70%、100.56%、100.32%,RSD为0.3%。50%目标浓度(14.05μg/ml)、100%目标浓度(28.10μg/ml)、150%目标浓度(42.10μg/ml)回收率分别为76.43%~77.12%、78.54%~80.06%、78.67%~79.44%,均符合规定的要求;6次检测100%目标浓度玻璃、不锈钢、陶瓷的RSD分别为0.4%、0.3%、0.3%。2名分析员在不同时间对100%目标浓度3种材质各做6个平行试验,RSD分别为1.3%、0.8%、0.9%。在ICP载气流量为0.5、0.6 L/min的条件下,将100%目标浓度3种材质擦拭溶液分别进样3次,3种材质的RSD分别为1.2%、0.2%、0.8%。结论建立的ICP检测法可用于分装车间清洁验证时铝残留物分析研究。

无菌异丙醇开瓶后有效期的初步研究

目的通过研究3个批次无菌异丙醇在3种不同洁净度的环境中开瓶后,瓶内外观、无菌状态及异丙醇含量是否受到环境影响,初步确定无菌异丙醇开瓶后有效期。方法从3个批次无菌异丙醇中每个批次随机选取162瓶,每个批次分别放置在A级、D级无菌室,无级别库房各54瓶。喷瓶的喷嘴始终处于打开状态,每个工作日进行3次喷雾操作。在第0、1、7、14、21、30天,检测异丙醇溶液的外观性状;采用薄膜过滤法测定异丙醇溶液中微生物的污染情况;采用气相色谱法测定异丙醇含量,并用独立样本t检验方法进行统计学分析。结果实验期间所有异丙醇溶液外观无变色、无沉淀、无悬浮物,气味无变化,未出现微生物污染;异丙醇含量为体积分数(69.98~70.17)%,达到标示含量。统计学分析显示,异丙醇含量差异无统计学意义(t值0.07~2.18,P值均>0.05)。结论无菌异丙醇在A级、D级无菌室和无级别库房开瓶后使用时间建议不超过30 d。

新型冠状病毒S蛋白抗体的制备及初步应用

目的制备新型冠状病毒S蛋白抗体,初步建立检测新型冠状病毒灭活疫苗抗原含量的方法。方法使用新型冠状病毒重组S蛋白分别免疫羊和兔,获得抗血清。采用间接ELISA法和微量中和试验检测抗血清效价,免疫印迹试验检测抗体特异性。采用蛋白G纯化树脂分别对羊和兔抗血清进行亲和层析纯化,获得抗体。以纯化后的羊抗体作为包被抗体,兔抗体作为显示抗体,建立新型冠状病毒灭活疫苗抗原含量检测方法。结果对羊进行4次免疫后,抗血清ELISA效价达220000,中和抗体效价达1536。对兔进行3次免疫后,抗血清ELISA效价达220000,中和抗体效价达4096。羊和兔抗体均可与新型冠状病毒S蛋白特异性结合。应用纯化后的抗体,成功建立了检测抗原含量的双抗体夹心ELISA方法,该方法线性良好,R^(2)>0.99,可用于新型冠状病毒灭活疫苗原液抗原含量的检测。结论成功制备了羊和兔抗新型冠状病毒S蛋白高效价抗体,并初步建立了新型冠状病毒灭活疫苗抗原含量检测的双抗体夹心ELISA方法。

环化二核苷酸对鼻喷流感疫苗免疫增强作用初步评价

目的评价环化二核苷酸(cyclic dinucleotides,CDN)对鼻腔喷雾流感病毒裂解疫苗的免疫增强作用,探讨将CDN用作黏膜佐剂的可能性。方法不同CDN配伍H1N1流感裂解疫苗免疫小鼠,免疫剂量血凝素(hemagglutinin,HA)4.5 μg/只,CDN 10 μg/只,两针滴鼻免疫间隔21 d,末次免疫后21 d检测免疫原性指标,包括血清血凝抑制(hemagglutination inhibition,HI)抗体效价、支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)sIgA效价及血清IgG效价,比较不同CDN的免疫增强作用;环二鸟苷酸(cyclic di-GMP,c-di-GMP)与壳聚糖(chitosan,CSN)分别配伍H1N1和H7N9流感裂解疫苗免疫小鼠,通过检测免疫原性指标,比较其对不同亚型流感病毒疫苗的免疫增强作用;c-di-GMP与CSN分别配伍H1N1流感疫苗,于末次免疫后21 d以10倍病毒半数致死量(median lethal dose,LD50)A/Puerto Rico/8/34(H1N1)流感毒株进行攻毒试验,连续14 d观察小鼠生存率的变化。结果3种CDN均能诱导较对照组更强的血清抗体、IgG、BALF sIgA和HI抗体阳转率;配伍H1N1和H7N9两种抗原,c-di-GMP与CSN佐剂组相比能诱导更高的血清HI、BALF sIgA水平;H1N1流感疫苗CDN免疫组和CSN佐剂组具有更高的攻毒保护率。结论CDN能增强流感抗原的免疫原性,且效果优于CSN佐剂。

常用消毒剂对Sabin株脊髓灰质炎病毒的杀灭效果

目的评价杀孢子剂、"84"消毒液、酸性苯酚盐、碱性苯酚盐对Sabin株脊髓灰质炎病毒的杀灭效果。方法采用中和剂鉴定试验鉴定消毒剂的中和剂。通过悬液定量病毒杀灭试验比较4种消毒剂对Sabin株脊髓灰质炎病毒Ⅱ型的杀灭效果。杀灭对数值>每毫升4.0 lg半数细胞培养感染量(50% cell culture infective dose,CCID50),表示达到消毒效果。结果中和剂鉴定结果表明,0.5%硫代硫酸钠可有效中和杀孢子剂和"84"消毒液的病毒杀灭作用,10%胰蛋白胨大豆肉汤培养基可有效中和酸性苯酚盐和碱性苯酚盐的病毒杀灭作用。杀孢子剂和1.0%"84"消毒液分别与病毒作用30 min,平均杀灭对数值均>4.0 lgCCID50/ml。0.5%"84"消毒液、酸性苯酚盐、碱性苯酚盐分别与病毒作用45 min,平均杀灭对数值仍<4.0 lgCCID50/ml,未达到消毒效果。结论杀孢子剂和氯含量较高的"84"消毒液对脊髓灰质炎病毒的杀灭效果远大于氯含量较低的"84"消毒液及酸性和碱性苯酚盐。