靶向胃癌干细胞单克隆抗体2C12的鉴定及功能研究

目的:研究胃癌干细胞的功能性单克隆抗体2C12体外功能实验,为胃癌干细胞的靶向治疗提供候选单抗药物。方法:以胃癌细胞系SNU-5为细胞模型,流式细胞术检测其亲本细胞和通过无血清悬浮培养的球体细胞中2C12+细胞的表达水平,双色细胞免疫荧光检测单抗2C12和CD90识别的抗原在SNU-5细胞中的表达情况。流式细胞术分选SNU-5细胞中2C12+和2C12-细胞,采用无血清悬浮培养成球实验和Transwell小室法分别检测其自我更新能力和侵袭能力。用单抗2C12处理SNU-5的球体细胞后,检测其对SNU-5的球体细胞自我更新能力和侵袭能力的影响。结果:2C12+细胞在SNU-5的球体细胞中的表达水平明显高于亲本细胞。免疫荧光结果显示单抗2C12识别的抗原分子能与CD90在SNU-5细胞上共定位。流式细胞术分选结果表明SNU-5细胞中2C12+细胞成球数明显高于2C12-细胞(103.3±9.07 vs 50.67±5.86)(P<0.01),侵袭能力也明显较高(209.3±12.9 vs 99.0±3.61)(P<0.01)。对2C12单抗的体外功能研究发现,不同浓度的单抗2C12(0μg/mL、20μg/mL、40μg/mL)能显著抑制SNU-5的球体细胞的成球能力(122.0±5.66、83.0±5.66、59.0±4.24),抑制率达到31.97%和51.64%,同时侵袭能力也显著降低(178.0±8.49、106.5±5.0、78.0±2.83),抑制率达到40.17%和56.18%。结论:单抗2C12是一株抗胃癌干细胞的功能性单抗,能够显著抑制胃癌干细胞的干性相关特征,为胃癌干细胞靶向治疗的候选抗体药物。

复合表面活性剂处理生物源性骨组织作为骨移植材料的生物安全性研究

目的应用新型的表面活性剂处理生物源性骨组织,对其进行脱细胞效果及生物安全性评价,以期得到一种更安全、可靠的骨植入材料。方法2种阴离子表面活性剂ABS(十二烷基苯磺酸钠)和AES(脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸钠)以及蒸馏水以重量比13:7:80的比例配制复合表面活性剂。以新鲜的牛松质骨为原料,复合表面活性剂脱脂脱细胞的两步法工艺,制备新型生物源性骨植入材料。对其进行组织学和表面超微结构观察,同时对表面活性剂处理的生物源性骨植入材料进行急性全身毒性试验、溶血试验、细胞毒性试验的生物安全性评价。通过骨长期植入试验观察表面活性剂生物源性骨的生物相容性和生物降解性。采用吸光度测量法界定骨材料中表面活性剂的残留量。结果复合表面活性剂生物源性骨颜色呈乳白色,无肉眼可见杂质,组织学及超微结构观察可见骨陷窝内细胞结构消失,骨小管空虚,胶原纤维排列整齐。生物安全性实验表明:按GB/T16886.11-1997急性全身毒性试验合格,溶血试验<5%,细胞毒性试验0级。复合表面活性剂生物源性骨组织中表面活性剂的残留量低于0.1g/L。骨长期植入实验表明:4周时可见骨组织周围纤维组织生成,骨小梁内有细胞爬入,植入材料与宿主骨融合良好。8周时植入材料部分被机体吸收,24周后被机体完全吸收。结论复合表面活性剂处理的生物源性骨移植材料具有良好的生物相容性和生物降解性,是一种安全、可靠的骨植入材料。

高脂饮食对生长期大鼠体质量和骨质量影响的研究

目的研究高脂饮食对生长期大鼠体质量和骨质量的影响。方法24只21日龄SD大鼠随机分为普食组和高脂组,n=12,雌雄各半。两组大鼠分别给予普通饲料和高脂饲料喂养6周后,测量体质量以及微计算机断层扫描技术(Micro-CT)扫描右侧股骨,比较两组大鼠体质量和骨质量的变化。结果喂养6周后,与普食组比较,高脂组大鼠的体质量明显增加,具有统计学差异(P<0.05),且雄性大鼠体质量的增长速度高于雌性;骨密度(BMD)降低,但仅在雌性大鼠中具有统计学差异(P<0.05);骨体积分数(BV/TV)及骨表面积骨体积比(BS/TV)降低,具有统计学意义(P<0.05);骨小梁间隙(Tb.Sp)增加,结果具有统计学差异(P<0.05);骨表面积体积比(BS/BV)和骨小梁厚度(Tb.Th)变化不明显,无统计学差异(P>0.05)。结论高脂饲料喂养的生长期肥胖大鼠,雄性更适合作为肥胖模型动物,而雌性肥胖大鼠更容易出现骨质疏松,形成骨量整体性缺失。

脱细胞真皮基质/生物矿化胶原一体化骨软骨支架的制备及其生物相容性的研究

目的成功制备脱细胞真皮基质/生物矿化胶原一体化骨软骨支架,并进行理化性质、生物力学与生物相容性评估,为骨软骨缺损修复提供理论依据。方法以物理和化学方法制备牛源脱细胞真皮基质,利用磷酸三钙和胶原,按照不同比例混合,利用自组装和冻干技术,制备以脱细胞真皮基质支架为软骨层,生物矿化胶原为骨层的骨软骨一体化双相支架。通过大体观察、扫描电镜观察、生物力学等检测,对骨软骨一体化支架进行理化性质和力学性能评价。原代培养小鼠软骨细胞和成骨细胞,并分别种植在脱细胞真皮基质和生物矿化胶原双相支架上,利用细胞毒、死/活细胞染色和增殖实验等观察细胞生长情况,测定骨软骨一体化支架的生物相容性。结果大体观察表明支架各层间结合紧密,未出现明显不连续和相互分离。扫描电镜各层内的孔隙结构相互连通且均具有立体多维性,其中脱细胞真皮基质、生物矿化胶原和双相支架的孔径分别为(121.6±8.65)、(98.40±5.56)和(103.2±3.94)μm。同时三组支架的压缩模量分别为(41.05±11.69)、(108.0±12.71)和(84.98±8.51)k Pa,弹性模量分别为(17.24±3.93)、(28.98±3.31)和(21.74±2.92)k Pa。MTT法表明骨软骨一体化支架无细胞毒性。荧光显微镜观察显示,纵切的支架薄片上细胞生长分布均匀,表明支架生物相容性较好,CCK8实验表明支架可以维持良好的细胞活性。结论脱细胞真皮基质/生物矿化胶原骨双相支架中上下层间的理化性能展示了骨软骨组织结构和力学方面的双重仿生,为动物体内实验奠定了基础,有望成为治疗骨软骨缺损修复的一种新手段。

外泌体在骨肉瘤中的研究进展

骨肉瘤是最常见的原发性恶性骨肉瘤,患者年龄呈双峰分布,其中儿童和青少年(中位年龄为18岁)的发病率最高,是儿童癌症相关死亡的首要疾病,60岁以上老年人的发病率位居第二,峰高较低。在世界范围内,骨肉瘤的年发病率为每百万人1~3例。骨肉瘤起源于间充质来源的原始转化细胞,具有恶性程度高、易复发、易转移、预后差等特点,大约20%的骨肉瘤在诊断时已扩散到肺、脑或其他器官。

针刺对青年期去卵巢骨质疏松大鼠骨代谢和骨质量的影响

目的观察针刺对青年期去卵巢骨质疏松模型大鼠骨代谢和骨质量的影响,探讨其治疗青年期骨质疏松症的作用机制。方法将40只SD雌性大鼠随机分为正常组、假手术组、模型组和针刺组,每组各10只。模型组和针刺组通过去卵巢制备青年期骨质疏松症大鼠模型,模型组不进行干预治疗,针刺组于术后第2周给予电针刺激“肾俞”“足三里”和“悬钟”,每日1次,连续治疗8周。通过酶联免疫法(ELISA)检测血清碱性磷酸酶(ALP)和骨钙素(OC)含量;通过Micro-CT检测股骨骨密度(BMD)和骨形态学参数。结果干预8周后,与正常组和假手术组相比,模型组和针刺组ALP和OC升高,BMD、骨体积分数(BV/TV)和骨小梁厚度(Tb.Th)减小,骨小梁间隙(Tb.Sp)增大(P<0.05),表明骨质疏松造模成功。与模型组相比,针刺组ALP和OC降低,BMD、BV/TV和Tb.Th增大,Tb.Sp减小(P<0.05),表明针刺能够提高骨密度,改善骨微结构。结论针刺具有预防青年期骨质疏松症的作用,其机制可能与针刺促进骨的形成和修复,提高骨密度,增强骨小梁的结构强度相关。

HSP90α和HSP90β蛋白在人骨肉瘤组织中的表达及临床意义

目的:探讨热休克蛋白HSP90α和HSP90β在骨肉瘤中的表达及意义。方法:采用免疫组化法检测90例骨肉瘤组织和21例癌旁组织中HSP90α和HSP90β的表达,并分析其与骨肉瘤临床病理特征的关系。结果:在骨肉瘤组织中,HSP90α和HSP90β的阳性表达率分别为57.78%和77.78%,均显著高于癌旁组织(P<0.05)。HSP90α高表达与骨肉瘤Enneking外科分期相关(P<0.05),而与患者性别、年龄、肿瘤位置无关(P>0.05)。HSP90β高表达与骨肉瘤Enneking外科分期相关(P<0.05),而与患者年龄、性别、肿瘤位置无关(P>0.05)。Spearman相关性分析显示,HSP90α和HSP90β在骨肉瘤中协同表达(r=0.247,P<0.05)。结论:HSP90α和HSP90β在骨肉瘤组织中共同表达上调,可能作为骨肿瘤潜在的诊断和治疗靶点。

脂肪血管基质成分复合骨软骨一体化支架的体外评价

背景:大量的动物和临床实验已证实,脂肪来源的血管基质成分局部移植可促进关节软骨修复。目的:探讨脱细胞真皮基质/生物矿化胶原一体化骨软骨支架复合脂肪来源血管基质成分构建组织工程软骨的可行性。方法:无菌条件下取出雌兔双侧腹股沟脂肪垫,利用酶消法获得血管基质组分,采用流式细胞仪检测其表面特异性蛋白,观察其成脂、成骨与成软骨分化能力。将脂肪来源血管基质成分(实验组)、含转化生长因子β3的脂肪间充质干细胞(软骨诱导组)、含体积分数10%胎牛血清的脂肪间充质干细胞(对照组)分别接种于脱细胞真皮基质/生物矿化胶原一体化支架上共培养,CCK8法检测细胞增殖,荧光显微镜下观察细胞数量,实时定量PCR检测软骨相关基因表达,二甲基亚甲基蓝比色法测定胞外基质中糖胺多糖含量。结果与结论:①流式细胞仪检测结果显示,脂肪来源血管基质成分高表达CD44、CD105与CD90,低表达CD14、CD19与CD45,脂肪来源血管基质成分具有向脂肪细胞、成骨细胞与软骨细胞分化的能力;②CCK8检测显示,随着培养时间的延长,脱细胞真皮基质/生物矿化胶原一体化支架上的3种细胞数量增加,其中实验组细胞数量高于其他两组(P<0.05);培养7 d荧光显微镜下观察可见,实验组中的细胞数量多于其他两组;③培养21 d的实时定量PCR检测显示,实验组中的Sox9、蛋白聚糖和Ⅱ型胶原mRNA表达量高于其他两组(P<0.05);④培养7,14,21 d的二甲基亚甲基蓝比色检测显示,实验组中的糖胺多糖含量高于其他两组(P<0.05);⑤结果表明,脂肪来源血管基质成分复合脱细胞真皮基质/生物矿化胶原一体化支架可以在体外有效支持软骨形成。

离心重力诱导脂肪间充质干细胞向软骨样细胞分化

目的探讨离心重力对人脂肪来源间充质干细胞(hADSCs)向软骨样细胞分化以及对Wnt/β-catenin信号通路的影响。方法通过加载不同离心力(0、500、1000、2000、2500、3000×g)和持续时间(0、15、30、45、60 min)刺激脂肪干细胞分化为软骨样细胞,并利用荧光定量PCR和Western blot检测Sox 9基因的上调表达来筛选条件,将培养的P3代h ADSCs分3组,对照组(不干预处理)、离心重力组和TGF-β3组(加入TGF-β3成软骨诱导剂),持续培养21 d后,通过阿利辛蓝和苏木精-伊红染色进行软骨分化鉴定,DMMB法测定胞外基质中GAG含量,荧光定量PCR测定Ⅱ型胶原基因表达,Western blot进一步检测对照组和离心重力组中Sox 9、β-catenin、GSK3β和p-GSK3β蛋白的表达。结果加载最适的离心重力(2500×g,30 min)刺激h ADSCs后,培养24 h,Sox 9的m RNA和蛋白表达显著上调。阿利辛蓝和苏木精-伊红染色显示,离心重力组和TGF-β3组中软骨表达呈阳性。GAG实验结果显示,TGF-β3组促GAG分泌的能力优于离心重力组(P<0.05),荧光定量PCR结果表明TGF-β3组其Ⅱ型胶原mRNA表达的能力高于离心重力组(P<0.05),Western blot结果显示,相比对照组,离心重力组中β-catenin和p-GSK3β的蛋白表达水平降低,而GSK3β和Sox 9蛋白表达升高。结论离心重力和TGF-β3诱导脂肪干细胞成软骨分化中的表达具有相似的能力,离心重力对h ADSCs诱导成软骨作用与抑制Wnt/β-catenin信号通路有关。

几种分散剂对纳米羟基磷灰石团聚、细胞内分布和细胞增殖的影响

背景:纳米羟基磷灰石具有优异的生物兼容性、生物活性及可修饰性,但是合成的纳米羟基磷灰石具有高比表面能,使得其在溶液中容易团聚。目的:比较超声以及不同分散剂对纳米羟基磷灰石团聚、细胞毒性及在细胞内分布的影响。方法:采用化学沉淀法合成针状纳米羟基磷灰石,高压灭菌后备用。将不同浓度的分散剂六偏磷酸纳(0,0.25,0.5,1,2 mmol/L)、柠檬酸钠(0,0.25,0.5,1,2 mmol/L)、聚甲基丙烯酸钠(0%,0.0625%,0.125%,0.25%,0.5%)分别与MC3T3E1细胞共培养,采用CCK-8法检测细胞增殖,筛选合适的分散剂作用浓度用于后续实验。将纳米羟基磷灰石溶液分5组处理:对照组不进行分散,其余4组分别进行超声分散、1 mmol/L六偏磷酸纳分散、1 mmol/L柠檬酸钠分散、0.125%聚甲基丙烯酸钠分散,检测纳米羟基磷灰石团聚尺寸。采用超声、1mmol/L六偏磷酸纳、1mmol/L柠檬酸钠、0.125%聚丙烯酸钠分散处理羟基磷灰石后分别与MC3T3E1细胞共培养,以未分散纳米羟基磷灰石与MC3T3E1细胞共培养为对照,采用CCK-8法检测细胞增殖,培养1 d时透射电镜观察下纳米羟基磷灰石在细胞内的分布。结果与结论:①1 mmol/L及更低浓度的六偏磷酸纳无明显的细胞毒性,0.25-2 mmol/L的柠檬酸钠均无明显的细胞毒性,不同浓度的聚甲基丙烯酸钠具有一定的细胞毒性,呈时间与浓度依赖性,后续实验选择1 mmol/L六偏磷酸纳、1 mmol/L柠檬酸钠、0.125%聚丙烯酸钠进行分散处理;②3种分散剂都显著降低了纳米羟基磷灰石的团聚尺寸,其中六偏磷酸纳的分散效果最好;③分散方式和分散剂的加入会显著影响纳米羟基磷灰石的生物学功能,柠檬酸钠会促进与纳米羟基磷灰石共培养的细胞增殖,超声和聚甲基丙烯酸钠会抑制与纳米羟基磷灰石共培养的细胞增殖;④透射电镜显示,对照组和超声组可见较大的纳米羟基磷灰石团聚块,团聚块存在于细胞内外;3种分散剂分散后的纳米羟基磷灰石也有团聚现象,但团聚尺寸明显变小,其中以六偏磷酸纳组的纳米团聚尺寸最小,有些纳米粒子在细胞内被双层膜包裹,形成类似"小液泡"的结构;⑤结果表明,常用的分散剂本身有一定的细胞毒性,分散剂的加入会显著降低纳米羟基磷灰石的团聚尺寸及其在细胞内的分布,影响细胞增殖。

HSP90β干扰和过表达慢病毒载体的构建及其在骨肉瘤细胞Saos-2中的表达

目的:获得热休克蛋白90β(HSP90β)基因干扰和过表达慢病毒表达系统,并检测其在人骨肉瘤细胞株Saos-2中的表达水平。方法:设计合成shRNA,以慢病毒表达质粒构建HSP90β干扰和过表达载体,酶切电泳、测序技术鉴定载体构建是否成功。重组病毒转染H1299细胞,以嘌呤霉素筛选稳定转染的Saos-2细胞,通过荧光显微镜观察计数获得转染效率。将感染好的细胞分为干扰NC组(NEG-shRNA)、干扰组(shRNA-HSP90β)、过表达NC对照组(NEG-pEZ)及过表达组(pEZ-HSP90β)。通过qRT-PCR与Western blotting分别从mRNA和蛋白表达水平验证目的基因的干扰和过表达水平。结果:插入慢病毒表达载体的基因片段与目的基因的碱基序列完全一致。病毒包装成功后,嘌呤霉素最小致死浓度1μg/ml,感染复数200,感染人Saos-2的感染效率达80%,其中shRNA-HSP90β组干扰效率为86.35%,pEZ-HSP90β组的mRNA相对表达量增加2. 8倍。进一步研究发现,shRNA-HSP90β组较NEG-shRNA组中HSP90β蛋白表达明显降低,p EZ-HSP90β组较NEG-p EZ组HSP90β蛋白表达增加。结论:HSP90β基因干扰和过表达慢病毒载体构建成功,并能够在Saos-2中稳定表达。

纳米羟基磷灰石对人骨肉瘤细胞U2OS增殖和凋亡的影响

目的:探索纳米羟基磷灰石(Nano-HAP)对人骨肉瘤细胞U2OS增殖和凋亡的影响。方法:不同浓度的Nano-HAP处理人骨肉瘤细胞U2OS后,通过FDA染色检测Nano-HAP对细胞黏附的影响;CCK8实验和克隆形成实验检测Nano-HAP对细胞生长增殖的影响;最后利用Annexinv-FITC凋亡检测试剂盒检测Nano-HAP对细胞凋亡的影响。结果:不同浓度的Nano-HAP对U2OS的黏附没有显著影响,但是对U2OS的克隆形成具有显著抑制作用,同时在50μg/ml和800μg/ml时,可以显著抑制骨肉瘤细胞U2OS的增殖。结论:Nano-HAP对骨肉瘤细胞具有显著的抑制增殖促进凋亡作用,但效应与纳米粒子浓度并无直接的线性关系。

激活的富血小板血浆促进Pellet培养的脂肪间充质干细胞成软骨样分化

目的探讨激活的富血小板血浆(PRP)对Pellet培养的人脂肪来源间充质干细胞向软骨样细胞分化及相关信号通路的影响。方法添加不同比例(5%、10%和15%)的激活PRP,检测不同培养时间(1、3、5、7、9、11 d)脂肪干细胞的增殖能力。将采用Pellet培养的P3代的h ADSCs分为3组,对照组、激活PRP组和含TGF-β3的软骨诱导组,持续培养21 d后,阿利新蓝和苏木精-伊红染色进行软骨分化鉴定,real-time PCR测定Sox-9、Aggrecan和II型胶原的基因表达,DMMB法测定胞外基质中GAG含量,Western blot进一步检测对照组和激活PRP组中Sox-9、Gli-1和BMP-2蛋白的表达。结果 MTT实验结果显示,在10%激活PRP培养条件下,11 d的生长时间内hADSCs的增殖率最适宜。阿利新蓝和苏木精-伊红染色显示,激活PRP组和软骨诱导组中软骨表达呈阳性。Real-time PCR结果表明软骨诱导组其Sox-9、Aggrecan和II型胶原mRNA表达的能力高于激活PRP组(P<0.05)。GAG实验结果显示,软骨诱导组促GAG分泌的能力优于激活PRP组(P<0.05)。Western blot结果显示,相比对照组,激活PRP组中伴随Gli-1和BMP-2的蛋白表达升高,而Sox-9蛋白表达随之升高。结论激活PRP刺激hADSCs的最适增殖能力的浓度比例为10%。激活PRP和软骨诱导剂对脂肪干细胞成软骨分化中的诱导表达具有相似的能力,激活PRP对h ADSCs诱导成软骨作用与Hedgehog和BMP信号通路有关。

真皮脱细胞基质复合骨髓间充质干细胞修复比格犬关节软骨缺损

背景:真皮来源细胞外基质作为软骨修复支架为软骨组织的生长提供空间支持,同时促进细胞黏附和增殖,骨髓间充质干细胞具有向软骨细胞诱导分化的作用,两者单独应用均有不足。目的:探索比格犬骨髓间充质干细胞复合小牛真皮脱细胞基质修复比格犬膝关节软骨缺损的可行性。方法:抽取比格犬骨髓血,采用密度梯度离心法获取骨髓间充质干细胞并传代。取新生小牛背部真皮组织,通过物理和化学方法脱除细胞成分,制备真皮脱细胞基质。真皮脱细胞基质表面缓慢滴加0.2 mL细胞悬浮液至完全覆盖支架,放在37℃、体积分数为5%CO2培养箱中静置48h备用。选取12只成年比格犬构建膝关节软骨缺损动物模型,随机分为3组:支架复合骨髓间充质干细胞组软骨缺损处缝合真皮脱细胞基质复合自体骨髓间充质干细胞;单纯支架组软骨缺损处缝合真皮脱细胞基质;模型对照组不进行处理。术后12周获取比格犬右膝关节组织,进行体视显微镜观察、苏木精-伊红染色和Ⅱ型胶原免疫组化染色。结果与结论:(1)扫描电镜显示骨髓间充质干细胞在脱细胞基质中黏附和生长良好;(2)苏木精-伊红染色显示,支架复合骨髓间充质干细胞组修复平面略低于周边正常组织,修复组织与周围软骨整合很好,单纯支架组软骨缺损处为纤维组织填充,模型对照组缺损周边仅有少量修复;(3)Ⅱ型胶原免疫组化染色显示,支架复合骨髓间充质干细胞组软骨缺损处为类软骨组织填充,单纯支架组软骨缺损处为纤维组织填充,模型对照组软骨缺损处无修复组织填充;(4)结果表明,新型小牛真皮脱细胞基质具有良好的生物相容性,可以促进骨髓间充质干细胞增殖,自体骨髓间充质干细胞与真皮脱细胞基质复合物可有效修复比格犬膝关节软骨缺损。

单克隆抗体18H12抑制PAMC-82胃癌干细胞的自我更新和侵袭能力

目的:探讨靶向胃癌干细胞的功能性单克隆抗体18H12对胃癌干细胞自我更新和侵袭能力的作用。方法:以胃癌细胞株PAMC-82为模型,用流式细胞术检测其亲本细胞和通过成球培养富集干细胞后细胞膜表面烯醇化酶1(enolase-1,ENO1)的表达水平,用流式细胞术分选出ENO1+和ENO1-细胞,并检测其自我更新和侵袭能力。以商业化的ENO1抗原和抗体作为样品,利用免疫共沉淀实验(co-immunoprecipitation,CoIP)验证靶向ENO1的18H12抗体能够准确识别ENO1。分别用18H12处理PAMC-82细胞12、24、48 h后,用甲基纤维素成球实验和Transwell小室法分别检测18H12对PAMC-82细胞自我更新和侵袭能力的影响。结果:细胞膜表面的ENO1在PAMC-82球体细胞中的表达水平明显高于亲本细胞(P<0.01),ENO1可作为一个靶向胃癌干细胞的潜在靶点。分选的ENO1+细胞的自我更新和侵袭能力明显强于ENO1-细胞和亲本细胞(P<0.05或P<0.01)。18H12抗体能够准确识别ENO1,与商业化抗体识别的条带一致。单抗18H12能显著抑制PAMC-82细胞的自我更新和侵袭能力(均P<0.01)。结论:单克隆抗体18H12能够显著抑制胃癌干细胞的自我更新和侵袭能力,有望成为靶向胃癌干细胞的候选抗体药物。