VEGF基因治疗靶向载体的构建及其特异性表达分析

目的 :构建KDR启动子介导的VEGF逆转录病毒载体pLXSN D2 99 KDRp VEGF1 6 5,并对其内皮细胞特异性表达作用进行分析。方法 :将逆转录病毒载体 3’LTR的U3区缺失 2 99个碱基使其自身启动子失活 ,然后重组pLXSN D2 99 KDRp VEGF1 6 5载体。经PA317细胞包装 ,NIH3T3细胞测定其病毒滴度。用高病毒滴度细胞株产生的病毒上清分别感染ECV30 4人脐静脉血管内皮细胞和NIH3T3细胞 ,收集细胞培养上清经ELISA和westernBlot分析。结果 :VEGF1 6 5在内皮细胞ECV30 4中的表达量明显高于NIH3T3细胞。结论 :构建的pLXSN D2 99 KDRp VEGF载体 ,可在内皮组织细胞中特异性地表达VEGF。

重组人白细胞介素－6与肿瘤坏死因子突变体融合蛋白的构建及表达

针对肿瘤坏死因子（ＴＮＦ）在肿瘤治疗剂量下产生的严重毒副作用及一些肿瘤细胞上白细胞介素－６（ＩＬ－６）受体明显增高的事实，根据ＴＮＦ结构与功能研究的最新信息，利用ＰＣＲ技术，对人ＴＮＦα基因进行了改造，并将其与人ＩＬ－６成熟肽编码区ｃＤＮＡ通过人工接头进行融合。融合蛋白在大肠杆菌中表达后，Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析表明，分子量约为３７ｋＤ；活性检测结果证实，该融合蛋白兼具有ＴＮＦ抗肿瘤活性和结合ＩＬ－６受体的能力，在高表达ＩＬ－６受体的人骨髓瘤细胞上测得的细胞毒活性较同样位点突变的ＴＮＦ高约３倍。

人睫状神经营养因子突变体基因克隆及高效表达

为了提高人睫状神经营养因子（ＣＮＴＦ）的生物学活性，用ＰＣＲ方法获取Ｎ端缺失１４个氨基酸的ＣＮＴＦ基因片段，经酶切鉴定、核酸测序证实突变体的核苷酸序列，将其重组至表达质粒ｐＢＶ２２０，构建了ＣＮＴＦ突变体表达载体ｐＢＶ－ＣＮＴＦΔ．用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ测定其表达水平，鸡胚背根节无血清培养法检测表达蛋白的生物学活性．结果表明，ｐＢＶ－ＣＮＴＦΔ能表达生物学活性高于天然ＣＮＴＦ的约２６ｋＤ蛋白质，表达水平达３０％．为今后通过基因工程方法获得ＣＮＴＦ突变体，从而制备高效的ＣＮＴＦ制剂创造了条件．

抑制性差减杂交方法克隆重力适应相关基因

采用抑制性差减杂交方法 ,分别从经重力环境改变适应性锻炼 (实验组 )和未经重力环境改变适应性锻炼 (驱动组 )的两组SD大鼠的淋巴细胞中分别提取RNA和mRNA ,并经逆转录酶合成dscDNA ,经RsaⅠ酶切后将实验组cDNA分为 2组 ,分别与两种不同的接头衔接 ,再与驱动组cDNA进行 2次消减杂交及 2次抑制性PCR ,将产物与T/A载体连接构建cDNA消减文库 ,并转染大肠杆菌进行文库扩增 .随机挑选 80个克隆 ,通过斑点杂交 ,初步筛选出 2

核转录因子-κB抑制剂对TNF抗前列腺癌作用的影响

目的 探讨NF κB与TNF抗前列腺癌作用的关系。 方法 合成全硫代修饰的双链寡核苷酸NF κB抑制剂 ;培养人前列腺癌细胞PC 3和成纤维细胞L92 9,体外分析NF κB抑制剂对TNF细胞毒作用的影响。制作PC 3细胞裸鼠动物模型 ,瘤块直径达 4mm时 ,肌注含有 94个氨基酸的前列腺分泌蛋白 (PSP94)和肿瘤坏死因子衍生物 11a融合基因的 pcDNA PSP94 TNFαD11a真核表达质粒DNA ,5 0 μg/只 ,给药一次 ;肌注NF κB抑制剂 5 μmol/只 ,连续给药 10d。设生理盐水和环磷酰胺对照组、pcDNA PSP94和pcDNA PSP94 TNFαD11a质粒DNA组、NF κB抑制剂组。 结果 以PC 3及L92 9为靶细胞 ,NF κB抑制剂对TNF的细胞毒作用无明显影响。动物实验结果显示 ,pcD NA PSP94 TNFαD11a和NF κB抑制剂联合用药组抑瘤率为 36 % ,是pcDNA PSP94 TNFαD11a组的1.8倍 ,pcDNA PSP94组与pcDNA PSP94+NF κB抑制剂组、NF κB抑制剂组与生理盐水组肿瘤大小均无明显差别。 结论 NF