基于理性设计的烟酰胺核糖激酶活性提升及应用

烟酰胺单核苷酸(nicotinamide mononucleotide,NMN)是NAD+的前体,补充NMN可有效恢复体内NAD+水平,并改善与NAD+下降相关的病理状态和疾病.目前NMN主要通过酶法生产,但是酶的催化活性较低,使得酶法合成NMN的成本仍然较高.来源于人的烟酰胺核糖激酶NRK1可以催化ATP和烟酰胺核糖合成NMN,因此,以提升烟酰胺核糖激酶NRK1的催化活性为目的,利用理性设计的策略和定点突变技术,通过氨基酸序列比对和结构分析,设计了NRK1的2个突变体NRK1(T47V)和NRK1(N62D),并在大肠杆菌中成功表达.实验表征发现,二者的催化特性均得到了提升,且NRK1(T47V)具有更好的催化特性,其活性较NRK1提高130%,催化效率k_(cat)/K_(m)和稳定性分别较NRK1提高了100%和20%.在较大反应体系中反应100 min时,NRK1(T47V)催化底物烟酰胺核糖的转化率为78%,较NRK1提高15.4%,产物NMN的产量为4.13 g/L,较NRK1提高38%.该结果表明,活性中心附近氨基酸的理性突变能显著提高NRK1酶的催化活性.

酶催化合成β-烟酰胺单核苷酸及关键酶

体内NAD^(+)会随着机体衰老出现系统性减少,从而引发年龄有关的生理功能下降和疾病发生.补充NAD^(+)的中间体β-烟酰胺单核苷酸(β-nicotinamide mononeucleotide,β-NMN),可有效平衡机体的NAD^(+)水平,改善衰老相关的病理和疾病状态.β-NMN作为抗衰老、治疗老龄性疾病的潜在活性物质,在食品和药品领域具有广阔的应用前景.与化学法相比,酶法合成β-NMN具有特异性强、高效、安全性高等优点,成为合成β-NMN的首选方法.现有酶催化合成β-NMN的路线报道不够全面,缺乏关于关键酶结构特征和催化特性等方面的研究报道.鉴于此,综述了β-NMN的4个酶催化合成路线及其关键酶的结构特征和催化特性,分析了不同酶法合成的优缺点及工业化应用的可行性.最后,讨论了现阶段酶催化合成β-NMN面临的难点和未来发展方向,以期为β-NMN的工艺优化和生产应用提供借鉴.

和厚朴酚衍生物HH-A通过与血红蛋白相互作用缓解动物模型脑缺血缺氧损伤

本研究旨在探讨一种新合成的和厚朴酚衍生小分子化合物HH-A在缺氧和永久性大脑中动脉闭塞条件下的抗缺氧以及减轻缺血缺氧所致脑损伤作用。利用大鼠低氧(11%氧含量)模型,给予HH-A 1 mg/kg(i.v.)和40 mg/kg(i.g.)以及和厚朴酚0.55 mg/kg,采用血气分析动脉血氧饱和度。利用大鼠永久性脑缺血模型,给予HH-A 0.25和1 mg/kg(i.v.),进行神经行为学评估,手术7天后取脑组织进行脑梗死体积测量。使用表面等离子共振技术进行HH-A靶蛋白钓取;利用缺氧探针评估脑组织缺氧程度;采用NeuN免疫荧光染色和H&E染色评估脑组织缺血缺氧损伤程度;分子对接试验分析预测HH-A与候选靶蛋白血红蛋白之间结合位点。结果显示,HH-A显著增加低氧状态下的血氧饱和度,并且显著减少脑组织的缺氧程度;在大鼠永久性脑缺血模型中,1 mg/kg HH-A显著减少神经行为评分,显著降低脑组织梗死体积,缓解脑组织的损伤;分子钓靶试验获得9个候选靶蛋白,分子对接试验进一步验证HH-A与血红蛋白之间具有很高的亲和力。研究表明,HH-A可能通过血红蛋白发挥抗缺氧作用,并且可以提高缺氧耐受性,减轻脑缺血缺氧损伤。

(2R，4S)-N-叔丁酰基-4-氨基-2-四氢吡咯甲酸甲酯的合成

以(2R,4S)-4-羟基-2-四氢吡咯甲酸为起始原料,经甲酰化,酰化引入叔丁氧羰基,手性反应,甲磺酰化,叠氮化及三苯基膦还原等7步反应合成了(2R,4S)-N-叔丁酰基-4-氨基-2-四氢吡咯甲酸甲酯(总收率29%),其结构经1H NMR和LC-MS表征。

维生素K2(35)关键中间体的合成研究

以2-溴-1,4-二甲氧基-3-甲基萘和溴代香叶醇为起始原料,经偶联反应和烯丙位末端氧化反应得到维生素K_2（35）关键中间体,总收率为64.9%,其结构经MS、^1H NMR、^13C NMR确证。

高效液相色谱法测定替格瑞洛含量

目的建立测定替格瑞洛含量的高效液相色谱法。方法色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18柱(250 mm×4.6 mm,5μm),以乙腈-水(50∶50)为流动相,检测波长为254 nm,柱温为35℃,流速为1.0 m L/min。结果主峰与前后杂质峰分离度为2.95和5.29;进样精密度的RSD为0.07%;当色谱条件有微小变化时,主峰与前后杂质峰分离度大于1.5;质量浓度线性范围为0.030 05~0.450 75 g/L,线性回归方程为Y=17 202 X-29.492,R2=0.998 9;重复性试验的RSD为0.10%;中间精密度试验的RSD为0.21%;回收率范围为98.32%~100.86%,RSD=0.95%。结论该测定方法操作简单,准确性、重复性好,可用于控制替格瑞洛原料药的含量。

富马酸沃诺拉赞的合成研究

目的开发一种合成富马酸沃诺拉赞的实用方法。提高收率,减少杂质、满足药品的质量要求。方法以5-(2-氟苯基)吡咯-3-甲醛为原料,经过N-磺酰化得到了5-(2-氟苯基)-1-(吡啶-3-磺酰基)-1H-吡咯-3-甲醛,采用甲醇重结晶除去了氯化物杂质,接着经过醛基的还原胺化、盐酸成盐除去二甲胺杂质,再中和形成沃诺拉赞,后经室温与富马酸成盐和甲醇/水(1∶1)重结晶后得到合格的富马酸沃诺拉赞。结果开发了一种实用的富马酸沃诺拉赞的合成工艺,可操作性高,杂质可控,收率提高4%,目标产物经过ESI-MS和1H NMR确认。结论研究得到了单杂<0.1%、纯度>99.5%的富马酸沃诺拉赞产品的合成工艺路线,该工艺适合工业化生产。

达格列净的合成研究

以5-溴-2-氯-4'-乙氧基二苯甲烷为原料,经过缩合反应得到2-氯-5-(1-甲氧基-D-吡喃葡萄糖-1-基)-4'-乙氧基二苯甲烷,除去甲氧基得达格列净粗品,然后通过上乙酰基、重结晶除去异构体,后再脱乙酰基得纯度较高的达格列净,最后再与S-丙二醇成溶剂化合物,得到目标晶型产物。达格列净产品单杂小于0.1%,纯度大于99.5%。产物经过ESI-MS、~1H NMR、热分析、X-粉末衍射确证。

异硫氰酸苄酯诱导脑胶质瘤U-87 MG细胞凋亡及其机制的研究

目的探讨异硫氰酸苄酯(benzyl Isothiocyanate,BITC)对人脑胶质瘤细胞系U-87 MG凋亡的诱导作用及其机制。方法 BITC作用U-87 MG细胞后,应用MTS法检测BITC对肿瘤细胞生长的影响,应用流式细胞术检测BITC对肿瘤细胞凋亡的作用和肿瘤细胞内活性氧(ROS)含量的变化,Western blot法检测细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、Survivin、caspase-3和caspase-8的变化,RT-PCR检测Bcl-2和Survivin基因的mRNA表达,最后检测信号转导分子JNK和转录因子AP-1转录活性的变化。结果 BITC对脑胶质瘤细胞U-87 MG具有明显的抑制作用,其IC 150值为15.2μmol·L-,流式细胞术检测显示10和20μmol·L-1的BITC作用24 h后凋亡率分别为29.3%和68.6%(P<0.05),2和5μmol·L-1BITC作用肿瘤细胞24h后,ROS产生分别为对照组的3.76倍和6.07倍(P<0.05),促凋亡蛋白caspase-3和caspase-8表达上调,抑制凋亡蛋白Bcl-2和Survivin表达下调,Bcl-2 mRNA表达分别是对照组的32.7%和19.2%(P<0.05),Survivin mRNA表达分别是对照组的41.3%和22.7%(P<0.05),JNK磷酸化水平上调,AP-1转录活性分别是对照组的42.5%和26.7%(P<0.05)。结论 BITC可抑制脑肿瘤细胞U-87 MG的生长,可能与细胞氧化损伤和调节细胞内的凋亡相关转录因子和信号通路有关。

异硫氰酸苄酯对脑胶质瘤U-87 MG细胞周期的影响及其机制

目的观察异硫氰酸苄酯(BITC)对人脑胶质瘤细胞系U-87 MG细胞周期的阻滞作用,并探讨其机制。方法取对数期U-87 MG细胞分别以2、5μmol/L的BITC处理,应用流式细胞仪检测细胞周期分布,Western blotting法检测细胞周期相关蛋白Cyclin B1、Cdc2、p21、Cdc25C及磷酸化Akt(p-Akt)蛋白表达,RT-PCR法检测Cyclin B1、Cdc2、p21和Cdc25C的mRNA表达,报告基因技术检测NF-κB、缺氧诱导因子(HIF)和真核细胞翻译起始因子4E(eIF4E)的转录活性。结果 BITC作用24 h后,U-87 MG细胞周期G2/M期比例显著升高,Cyclin B1、Cdc2、Cdc25C、p-Akt蛋白表达下调,p21蛋白表达上升,Cyclin B1、Cdc2、Cdc25C、p21 mRNA表达均显著下降,NF-κB、HIF、eIF4E转录活性均显著下降(P均<0.05)。结论 BITC对U-87 MG细胞周期有阻滞作用,机制可能与抑制Akt/NF-κB信号转导路径,进而调节细胞周期相关基因表达有关;此为胶质瘤的细胞周期靶点治疗提供了新思路。

安立生坦的合成研究

以二苯甲酮为原料,经5步反应得到安立生坦,并优化了拆分和取代步骤。在拆分步骤中采用化学性质稳定且便于检测的L-苯甘氨酰胺作为拆分试剂,获得具有较高光学纯度的中间体。在取代反应中采用安全性较高的氢氧化钠作为强碱,适合工业生产。该工艺反应条件温和,操作简便,总收率达到31.0%,具有良好的应用前景。

新化合物W026B通过抑制炎性细胞因子的产生减轻缺血性脑损伤,与tPA合用作用增强（英文）

神经保护被认为是缺血性脑卒中的重要治疗方法之一。炎症在缺血性脑卒中的发病机制中起着重要作用,抑制缺血性脑组织的炎症反应可能起到神经保护作用。本研究观察了新化合物W026B对小鼠永久性大脑中动脉阻塞模型(pMCAO)和短暂性大脑中动脉阻塞模型(tMCAO)的保护作用和对缺血侧脑组织NF-κB和一些炎性细胞因子表达的影响。在pMCAO模型中静脉注射W026B 10μg/kg和100μg/kg可明显减少小鼠缺血脑梗塞体积,100μg/kg W026B显著降低神经功能缺陷评分和脑含水量; 10μg/kg和100μg/kg W026B可减少血管内伊文思蓝渗出至缺血脑组织。与假手术组相比,缺血脑组织中细胞核内的NF-κB水平升高了17.6倍,组织中的TNF-α、IL-1β和IL-17分别升高了2.3倍、2.2倍和3.8倍,100μg/kgW026B可显著减少这些炎性细胞因子的水平。在tMCAO模型中,缺血组织中的NF-κB、TNF-α、IL-1β和IL-17的也分别升高2.3倍、1.4倍、1.5倍和1.4倍,100μg/kg的W026B也可显著减少这些炎性细胞因子的产生。在小鼠血栓栓塞e MCAO模型中W026B单独应用也可检索小脑梗死体积,与t PA联合应用作用增强。总之,W026B在三种脑缺血模型上均具有明显的保护作用,这些保护作用与其减少细胞核中的NF-κB的含量,减少TNF-α、IL-1β和L-17的产生有关。这些结果提示W026B可能具有进一步研究的价值。

具有脑保护作用的化合物W026B的蛋白质组学研究和靶点发现（英文）

W026B是一种对小鼠脑缺血再灌注(I-R)损伤具有保护作用的新化合物,但其具体的作用机制尚不明确。本研究应用蛋白质组学观察了W026B在I-R损伤脑组织中对蛋白表达的影响,并试图揭示其潜在的靶点。通过蛋白质组学共检测到4852种蛋白,在脑I-R模型组和W026B治疗组中发现了42种发生显著变化的蛋白,这些蛋白大多与免疫炎症、代谢、神经保护以及细胞增殖和细胞结构有关。经Westernblotting验证,在五种候选蛋白中有三种蛋白表现出与蛋白质组学检测结果一致的改变。我们选择RGS17作为进一步研究的对象,利用siRNARGS17敲低RGS17蛋白后加重了脑损伤,并抵消了W026B的保护作用。W026B可与RGS17结合(KD:6.04×10–6mol/L)。RGS17的下调加重了I型代谢型谷氨酸受体激动剂(I型m GluRs)诱导的Neuro-2a细胞损伤,并抵消了W026B的保护作用。综上所述,W026B通过影响多种蛋白保护大脑免受I-R损伤,RGS17可能是W026B的靶点之一,也是潜在的脑I-R损伤治疗靶点。受W026B影响的RGS17调节的G蛋白上游受体可能是I型mGluRs。本研究为W026B的进一步研发和潜在的临床应用提供了有益的证据。

B55γ蛋白对t-MCAO模型小鼠中W026B神经保护作用的影响

W026B是一种新合成的木脂素衍生物,已被证明是一种神经保护剂。已有研究表明:W026B可以在不同的模型中显著减少动物脑梗死体积,改善动物行为学评分,并保护血脑屏障,但其发挥保护作用的确切机制仍不清楚。B55γ蛋白是我们前期通过蛋白质组学筛选而得的W026B作用的目标蛋白之一,本研究探究其对t-MCAO小鼠中W026B保护作用的影响。用siRNA PPP2R2C敲低脑组织中B55γ蛋白的表达,以观察B55γ蛋白对W026B作用的影响。结果表明:敲低B55γ蛋白的表达水平可显著抑制W026B的脑保护作用。进一步研究结果显示:敲低B55γ蛋白的表达消除了W026B降低缺血性脑组织中NF-κB p65水平的作用,同时也逆转了W026B降低缺血性脑组织中caspase-3活性的作用。综上所述,蛋白B55γ可能是W026B发挥脑保护作用的重要调节因子,B55γ可通过影响缺血再灌注过程中的炎症反应和凋亡途径密切参与W026B的脑保护作用。这些结果揭示了W026B的神经保护作用的新机制。

糖苷酶耐热性改造策略与应用

糖苷酶作为绿色温和的生物催化剂,能够水解包含糖苷、寡糖、多糖等在内的各种含糖化合物的糖苷键生成具有高生理和药理活性的衍生物,在食品、医药等工业领域应用广泛。而工业应用的糖苷酶经常需在高温条件下进行催化,以提高反应效率并减少污染,但大多数糖苷酶属于中温酶,在实际生产条件下的活性较低且损失较快,因此,提高糖苷酶在高温下的稳定性非常重要。本文综述了近年来利用定向进化、理性设计和半理性设计等策略改造糖苷酶耐热性的研究进展与应用,比较了不同策略之间的优势与不足,并对未来糖苷酶耐热性的改造方向进行了展望。

异硫氰酸苄酯对脑胶质瘤 U-87 MG细胞活性氧的诱导作用及其机制研究

目的探讨异硫氰酸苄酯(benzyl isothiocyanate,BITC)对人脑胶质瘤细胞系U-87 MG的活性氧(ROS)的诱导作用及其机制。方法应用MTS法检测BITC对肿瘤细胞生长的影响,2和5μmol·L-1 BITC作用U-87 MG细胞后,应用流式细胞术检测肿瘤细胞内活性氧(ROS)含量的变化,生化法检测GSH以及氧化应激相关的线粒体呼吸链复合体Ⅲ、过氧化物歧化酶(SOD)和醌还原酶(quinone reductase,QR)的活性变化,Western blotting法和报告基因技术检测p38-MAPK和相关转录因子ARE的转录活性变化。结果 BITC对脑胶质瘤细胞U-87 MG具有明显的抑制作用,其IC50值为15.2μmol·L-1,2和5μmol·L-1 BITC作用肿瘤细胞24 h后,ROS产生分别为对照组的376.3%和607.5%(P<0.05),GSH水平分别为对照组的71.3%和44.9%(P<0.05),SOD活性分别为对照组的63.5%和21.8%(P<0.05),QR活性分别为对照组的55.2%和26.7%(P<0.05),呼吸链复合体III活性分别为对照组的48.5%和37.6%(P<0.05),p38-MAPK的磷酸化水平显著上升,ARE的转录活性分别为对照组的141.1%和215.2%(P<0.05)。结论 BITC可诱导脑肿瘤细胞U-87 MG中ROS产生,可能与调节胞内的氧化应激相关基因表达有关。

W026B对大鼠全脑缺血再灌注损伤的保护作用

脑缺血在世界范围内严重影响着人类的生活质量和生命健康。W026B是一种新合成的木脂素衍生物,对局灶性脑缺血/再灌注模型具有保护作用,但W026B对全脑缺血/再灌注(GCI/R)模型是否具有脑保护作用尚不清楚。本文研究了W026B对四血管闭塞性全脑缺血再灌注模型是否具有脑保护作用。结果显示:W026B明显提高了GCI/R后7天的大鼠存活率,显著改善了GCI/R后7天内的神经功能缺陷评分,明显增强了GCI/R大鼠海马中存活神经元的数量。此外,W026B明显降低了GCI/R大鼠海马组织中ROS的水平,并增加了SOD的活性;明显降低NF-κB p65的表达和IL-6的水平,W026B也降低了caspase-3的活性。这些结果首次证明了W026B对GCI/R大鼠具有脑保护作用,其作用可能与抑制GCI/R过程中的氧化应激、炎症反应和细胞凋亡有关。本研究为W026B对脑缺血/再灌注损伤的保护作用提供了新证据。