具长效性重组人血清白蛋白/粒细胞刺激因子融合蛋白的理化特性研究

目的对符合制药要求的高纯度重组人血清白蛋白/粒细胞刺激因子融合蛋白原料药开展理化特性研究。方法利用基因工程技术构建了可高效表达重组人血清白蛋白/粒细胞刺激因子融合蛋白(rHSA/GCSF)的毕赤酵母工程菌,rHSA/GCSF直接分泌到组分简单的无机盐培养基中,而后经特别建立的高效分离纯化工艺进行分离纯化。通过理化分析手段,首次获得rHSA/GCSF的多项理化特性指标和结果。结果 rHSA/GCSF原料药的蛋白质纯度达到98%以上;肽质量指纹图谱匹配率为84%;N-端氨基酸序列前15个氨基酸与理论序列相符;质谱分子量测定结果为85305D,与理论分子量85215D值相近;自由巯基含量为2.4;融合蛋白经圆二色光谱分析比对表明HSA和GCSF各自的空间构象未变;等电点(pI)约为5.8;融合蛋白为非糖基化蛋白、紫外光谱呈现典型蛋白质光谱;原料药中的细菌内毒素、宿主蛋白质、外源性DNA、甲醇和甘油的残留量符合作为药物的要求。融合蛋白的免疫学鉴别为阳性;体外细胞学生物比活性测定结果值为1.5×107IU/mg,与单体rGCSF的等摩尔比没有显著差异。结论研究获得的方法和结果可作为指导《注射用重组人血清白蛋白/粒细胞刺激因子融合蛋白》原料药的质量标准和制检规程的基础。

重组人血清白蛋白/干扰素α2a融合蛋白的药效学、药代动力学及安全性评价

目的对具有独立自主知识产权的注射用重组人血清白蛋白／干扰素α2a融合蛋白新药的临床前药效学、药代动力学和安全性评价进行研究。方法通过重组人血清白蛋A／干扰素α2a融合蛋白（rHS-IFNα2a）对HepG22．2．15分泌乙型肝炎病毒（HBV）细胞作用产生的抗病毒进行体外药效学评价；以给药后的食蟹猴体内2＇-5’寡腺昔酸合成酶活性作为干扰素药效学标志基因表达考察药效动力学指标；药代动力学观察了不同剂量的挖^125rHSA／IFNα2a单次皮下注射给予小鼠、大鼠后，各组织器官的分布、排泄情况及rHSA／IFNα2a单次和多次皮下注射给予食蟹猴后其体内的代谢情况：安全性评价中，安全药理学研究观察了rHSA／IFNα2a对小鼠中枢神经系统及对狗呼吸和心血管系统功能的影响：毒理学研究观察了rHSA／IFNα2a单次注射给予小鼠（皮下和静脉）、食蟹猴（皮下）的毒性反应，及反复皮下注射给予大鼠和食蟹猴的毒性反应，食蟹猴反复给药的毒性试验中还伴行了毒代动力学的研究。妊娠Wistar大鼠皮下注射给予rHSA／IFNα2a对孕鼠生殖能力及胎仔的影响。结果试验药物rHSA／IFNα2a和阳性对照品（PEG-rhlFNα2a）的最大无毒剂量为3．13×10^3IU／ml，当以低于最大无毒剂量的rHSA／IFNα2a和阳性对照品处理HepG22．2．15细胞，显示细胞分泌HBV病毒的能力受到抑制。细胞上清液中的HBV核酸量随时间而减少，HBV的S抗原和e抗原表达也同步受到抑制，与PEG．rhlFNα2a对HBV病毒分泌的相对抑制率检测结果相同。药代动力学研究结果显示静脉rHSA／IFNα2a给药组和对照组的t1／2分别为（88．88±9．65）h和（35．81±4．91）h：食蟹猴皮下注射末端半衰期较长为61．20-83．57h。安全药理学研究表明单次皮下注射重组人血清白蛋白／干扰素α2a融合蛋白在100、300、600gg／kg剂量范围内对小鼠中枢神经系统无明显影响，与戊巴比妥钠无协同作用；在50、200pg／kg剂量范围内对狗呼吸和心血管系统无明显影响。rHSA／IFNα2a单次皮下和静脉给予小鼠的最大耐受量≥50mg/kg，单次皮下注射给予食蟹猴的耐受剂量≥10mg／kg。以100、300和1000μg／kg剂量反复皮下注射rHSA／IFNα2a给予大鼠，以50、150和500μg／kg反复皮下注射给予食蟹猴，每周给药1次，连续13周，基本安全剂量分别为1000gg／kg和500gg／kg，注射局部仅见可逆的轻度刺激性反应；多次给药后，动物体内产生抗rHSA／IFNα2a和IFNα2a的抗体，且抗体具有中和rHSA／IFNα2a活性的作用，且停药4周后，抗体滴度明显降低。多次给药后由于中和抗体的产生，血浆中的抗原量低于检测限。单次给药食蟹猴各代谢动力学参数呈现线性动力学特征。当给药剂量高达1000gg／kg时未见孕鼠母体毒性和胎仔毒性，提示rHSA／IFNα2a无致畸作用。结论获得的大量药效学、药代动力学、毒理学试验数据显示rHSA／IFNα2a具有较好的安全性、成药性和长效性，研究结果可供正在开展的临床试验研究参考。

两种具长效性重组人血清白蛋白/干扰素α融合蛋白表达工程菌的构建及融合蛋白的理化特性研究

目的对两种长效干扰素α融合蛋白原料药的理化特性多项指标开展分析和进行比较。方法利用基因工程技术分别构建了可高效表达重组人血清白蛋白/干扰素α2a融合蛋白(rHSA/IFNα2a)或重组人血清白蛋白/干扰素α2b融合蛋白(rHSA/IFNα2b)的毕赤酵母工程菌。融合蛋白直接分泌到组分简单的无机盐培养基中,并经特别建立的高效分离纯化工艺进行纯化,随后对两个融合蛋白进行详尽的理化特性分析。结果获得的融合蛋白纯度在98%以上;N端前15个氨基酸序列与理论序列相同;质谱分子量分别为85640.8D和85781.5D;圆二色光谱分析比对蛋白空间构象未变;等电点pI约在5.1左右;为非糖基化蛋白;紫外光谱呈典型蛋白质光谱;自由巯基含量测定值为1.4;肽图批次间一致;肽质量指纹图谱可匹配分别达83%和82%;对制备的2个融合蛋白原料药中的细菌内毒素、宿主蛋白质、外源性DNA、甲醇和甘油的残留量检测符合标准要求;融合蛋白的免疫学鉴别为阳性;体外细胞生物比活性约为2.5×105IU/mg,并且2个融合蛋白生物比活性测定值无不同,由此,获得了符合临床用药标准的原料药。结论研究所获得的结果可以作为指导《注射用重组人血清白蛋白/干扰素α2a融合蛋白》和《注射用重组人血清白蛋白/干扰素α2b融合蛋白》2个新药的原料药生产质量标准的建立和检定方法的确定。