4℃保存红细胞内皮型一氧化氮合酶表达情况的研究

目的鉴定红细胞(RBCs)中有无内皮型一氧化氮合酶(eNOS),探讨在4℃保存条件下,RBCs中的eNOS含量随保存时间变化的规律。方法采用免疫印迹(WB)和免疫荧光技术检测库存红细胞膜标本中有无eNOS;采用逆转录-PCR(RT-PCR)技术eNOS-mRNA库存红细胞中的检测。结果 RBCs中eNOS检测结果呈阳性。灰度分析结果表明:在RBCs保存35 d内,并不能引起eNOS含量的变化;而RBCs中并没有检测到eNOS-mRNA的存在。结论 RBCs含有eNOS;在库存血液35 d的保存期内,RBCs中的eNOS含量保持稳定。另外,在RBCs中未发现有eNOS-mRNA存在。

8种呼吸道感染病原体抗原片的研制及临床检测

呼吸道传染病是高发流行病,具有人群普遍易感,诱发原因广泛,传染性强,传播速度迅速,较难控制等特点[1],如今呼吸道感染已占儿科门诊的60%以上。而快速高效地诊断出患者感染的呼吸道病原体类型有助于尽快确定治疗方案,防止病情加重和迁延不愈。血清学检测是临床常用的呼吸道传染病初步筛查、诊断方法。间接免疫荧光法是临床检测的经典及金标准实验[2],因其方便、灵敏、特异、高效的特点常用于临床病原体的初步诊断。

柯萨奇病毒B组IgM抗体检测抗原片的研制,优化及应用价值的研究

柯萨奇病毒B组（CoxB）是单股正链小RNA病毒,是呼吸道感染的主要病原体之一。根据血清型,该B组病毒可分为B1、B2、B3、B4、B5、B6六种类型,主要侵犯免疫力底下的围生儿,可引起脑膜炎,中枢神经系统感染等多种疾病,亦是引起病毒性心肌炎的主要病原体之一,占病毒性心肌炎诱因的20%-25%,病情严重者可导致死亡。CoxB传染源为病人及隐性感染者,可经口、呼吸道、肠道传播或胎儿宫内传染。

人巨细胞病毒pp150-pp65蛋白的表达与应用

目的构建并表达人巨细胞病毒(HCMV)pp150-pp65蛋白,将纯化的重组蛋白制备成胶体金试剂盒对其抗原性进行评价。方法采用PCR方法扩增HCMV pp150-pp65基因片段,连接到原核表达载体pET28a进行表达并纯化,采用SDS-PAGE和Western blot进行鉴定,并与北京英诺特生物技术有限公司合作研制出巨细胞IgG/IgM抗体联合检测试剂盒(胶体金法),与进口试剂盒(酶免法)进行临床标本比对试验。结果成功构建了HCMV的高效表达载体pET28a-pp150-pp65,并得到分子量在45kd的高表达蛋白,具有良好的抗原性。将该蛋白制备成胶体金试剂盒,经600份血清标本的检测,与进口CMV-IgG试剂盒进行比对,本试剂盒的阳性符合率和阴性符合率分别为92.7%和83.1%,总的符合率为90.2%;与进口CMV-IgM试剂盒进行比对,本试剂盒的阳性符合率和阴性符合率分别为88.1%和89.2%,总的符合率为88.5%,稳定性良好。结论高效表达纯化的pp150-pp65重组蛋白抗原性强,利用其建立的胶体金试剂盒与国产已上市试剂盒和进口试剂盒比对,不仅具有较高的灵敏度和特异性,而且经初步临床应用,表明该试剂盒能检测不同临床感染阶段的患者,具有较好的市场前景。

甲型流感病毒快速基因分型POCT方法的建立

目的建立一种无需核酸提取,直接检测鼻咽拭子中甲型流感病毒H1HA pdm09、H3HA亚型和季节性流感病毒H1HA non-pdm09的POCT快速分型方法。方法针对3种流感病毒的血凝素(hemagglutinin,HA)基因序列保守区设计高度特异性的引物和HyBeacon探针,同时以人类RNaseP基因作为内参。优化多重PCR反应条件,建立用熔解曲线分析甲型流感病毒基因分型的方法,并将其应用到ParaDNA核酸POCT检测仪,对50例甲型流感病毒抗原初筛阳性且经过实时荧光定量PCR检测的临床鼻咽拭子标本进行检测。结果该方法可在1.5 h内完成对3种甲型流感病毒亚型HA基因的特异性扩增和分型,与其他7种呼吸道病原微生物无交叉反应,其核酸检测下限为50 copies/μl。对临床50例甲型流感病毒抗原阳性的鼻咽拭子标本进行直接检测,检出H1HA pdm09阳性标本48例,H3HA阳性标本2例,未检出季节性流感H1HA nonpdm09阳性标本。结论基于HyBeacon探针和ParaDNA核酸POCT检测仪所建立的甲型流感病毒快速分型方法能同时检测H1HA pdm09、H3HA和季节性流感病毒H1HA non-pdm09。该方法无需核酸提取,操作简便,检测时间短,适于对甲型流感病毒抗原初筛阳性的鼻咽拭子开展现场基因分型检测,可为流感的诊治和防控提供及时快速的实验室依据。

两种检测柯萨奇病毒B组IgG抗体胶体金方法的建立及比较

目的:建立两种胶体金反应体系检测柯萨奇病毒B组IgG抗体并进行比较,选出合适的检测方法。方法:利用胶体金标记柯萨奇重组抗原做金标垫,鼠抗人IgG包被做检测线建立捕获法反应体系;利用胶体金标记鼠抗人IgG做金标垫,包被柯萨奇重组抗原做检测线建立间接法反应体系,通过实验选出性能较好的试剂盒并与进口试剂盒(酶联免疫法)进行临床标本比对实验。结果:捕获法同临床已知样本的阳性符合率和阴性符合率分别为97.96%和98.80%,总符合率达到98.67%,间接法同临床已知样本的阳性符合率和阴性符合率分别为93.88%和98.80%,总符合率达到98.00%;在抗干扰实验中,捕获法与间接法对ANA阳性、高脂、黄疸共47例干扰因子样本均有较好的抗干扰性能;但在检测RF阳性样本时,间接法体系研制而成的试剂出现1例假阳性反应;对600例临床样本进行检测,柯萨奇病毒B组IgG抗体捕获胶体金检测试剂与进口试剂盒的阳性符合率和阴性符合率分别为97.82%和99.40%,总符合率达到99.17%。结论:经初步临床应用,表明利用捕获法原理建立的检测试剂盒比利用间接法建立的更灵敏,抗干扰性能更强,而且与进口试剂盒比对,有较高的灵敏度和特异性,具有较好的应用前景。