组织工程皮肤修复全层皮肤缺损的实验研究

目的探索由人表皮干细胞、成纤维细胞与纤维蛋白支架构建的组织工程皮肤修复全层皮肤缺损的可行性。方法将人全层皮肤采用胰蛋白酶消化法使表皮干细胞和真皮成纤维细胞分离后,分别在无血清培养基中行原代及传代培养。将体外扩增培养至第3、4代的表皮干细胞(5×104/mL)和真皮成纤维细胞(1×104/mL)共0.5mL与纤维蛋白支架(0.5mL)混合凝固构建组织工程皮肤。取4～5周龄雄性裸鼠45只,体重19.5～20.3g,平均20.0g,制备背部全层皮肤缺损模型。随机分为5组,每组9只,分别为空白对照组(C组),创面仅覆盖凡士林油纱,自然愈合;单纯支架组(F组),创面移植无细胞的纤维蛋白支架;表皮支架组(S组),创面移植含有表皮干细胞的纤维蛋白支架复合物;成纤维细胞支架组(Fb组),创面移植含有成纤维细胞的纤维蛋白支架复合物;组织工程皮肤组(T组),创面移植组织工程皮肤。术前及术后1、3、6、8周行全身及移植部位大体观察;移植后3、6、8周,取材行组织学、免疫组织化学及扫描电镜观察。结果?细胞培养4周后,表皮干细胞培养皿内可见圆形细胞,在加有BrdU的培养液中培养6d后可见BrdU染色阳性细胞;成纤维细胞培养皿内可见梭形细胞。构建的组织工程皮肤可见CK19免疫荧光染色阳性细胞、Nestin染色阳性细胞。移植后T组新生皮肤较其余各组生长快、瘢痕轻。术后6周,C、F、S、Fb及T组皮肤厚度分别为:(0.460±0.049)、(0.480±0.055)、(0.540±0.043)、(0.510±0.032)及(0.660±0.047)mm,T组明显厚于其余各组,且差异有统计学意义(P<0.05)。术后3、6、8周,HE染色及扫描电镜示,T组新生表皮层数及真皮成纤维细胞、血管数量均多于其余各组,且T组真皮血管及胶原纤维排列均较其余各组整齐;术后3周,Ⅳ型胶原免疫组织化学染色显示,T组已形成连续的染色带,而其余各组均不连续;术后6周,CK14免疫组织化学染色显示,T组可见阳性细胞,其余各组均未见。结论用表皮干细胞、成纤维细胞及纤维蛋白支架构建的组织工程皮肤移植后能使创面迅速愈合,可望成为一种较理想的组织工程皮肤。

人皮肤成纤维前体细胞的分离培养及其功能鉴定

目的以人的皮肤为材料,拟在体外成功分离培养成纤维前体细胞并研究其除皱整形能力。方法组织块法分离人的皮肤成纤维前体细胞,并通过RT-PCR、流式细胞仪、软琼脂克隆等实验技术对分离的皮肤成纤维前体细胞进行鉴定,同时进行免疫荧光、动物实验检测其在治疗真皮损伤以及除皱整形方面的作用。结果成功分离并扩增人的皮肤成纤维前体细胞,优化了原代细胞的分离方法,RT-PCR和流式细胞仪检测结果显示该细胞表达部分干细胞表面标记HLA-I、HLA-DR、CD90以及CD105,软琼脂克隆实验表明该细胞不具有致瘤性。免疫荧光结果显示,注射该细胞的裸鼠与对照组相比,真皮层产生更多的I型胶原蛋白,皮肤厚度增加。结论一次取材,体外能够成功持续获得人的原代皮肤成纤维前体细胞,优化了原代细胞分离方法。并且该细胞注射后可以在一定程度上分化为成纤维细胞,产生胶原蛋白,修复受损皮肤。

培养细胞污染支原体的PCR检测方法的建立及应用

在生物制剂的生产和研发领域，细胞培养扮演着极其重要的角色：用原代细胞或传代细胞制造疫苗；杂交瘤细胞制造单克隆抗体；基因工程或细胞生物学的研究等。然而支原体污染常常成为细胞培养的不速之客，严重影响着细胞及生物制剂的质量。污染细胞最常见的支原体包括：

人脐带间充质干细胞移植对小鼠干燥综合征的治疗作用及其机制

背景干眼的发病率有逐渐升高的趋势，炎症反应参与干眼的发生和进展过程，而目前的治疗方法通常仅能缓解症状，而不能达到彻底治愈的目的。已有研究将干细胞移植用于眼表损伤引起的角膜缘干细胞缺乏症，但干细胞是否可用于干眼及其作用机制的研究鲜见报道。目的探讨人脐带间充质干细胞（HUCMSCs）移植治疗干燥综合征的可行性及治疗途径。方法采用完全随机方法将20只24周龄雄性NOD／Ltj小鼠分为尾静脉注射组、泪腺注射组、点眼组和模型组，分别采用HUCMSCs悬液尾静脉注射法、泪腺注射法和点眼法进行HUCMSCs移植，模型组小鼠不移植HUCMSCs，采用ICR雄性小鼠5只作为正常对照。分别于注射后1、2和3周采用酚红棉线法测量各组小鼠的泪液分泌量；采用角膜荧光素钠染色法对角膜上皮的缺损情况进行评分；采用ELISA法检测各组小鼠血清白细胞介素（IL）-6、IL-17a、肿瘤坏死因子-α（TNF—α）和γ干扰素（IFN-γ）质量浓度；采用Western blot法检测各组小鼠泪腺组织中p65、Stat3、Stat5和细胞外信号调节激酶-1（Erk-1）的相对表达量。对各组小鼠上述指标的测定结果进行比较。结果模型组、尾静脉注射组、泪腺注射组和点眼组NOD／Ltj小鼠干预后1、2和3周时组间泪液分泌量的总体比较差异均有统计学意义（第1周：F=3．700，P=0．040；第2周：F=5．150，P=0．008；第3周：F=10．130，P〈0．001），其中注射后第1、2和3周尾静脉注射组、泪腺注射组小鼠的泪液分泌量均明显多于模型组，差异均有统计学意义（均P〈0．05），但各时间点点眼组小鼠的泪液分泌量与模型组比较差异均无统计学意义（均P〉0．05）。注射后1周ICR小鼠对照组、模型组、尾静脉注射组、泪腺注射组和点眼组角膜荧光素钠染色评分分别为3．00±0．63、9．40±1．62、5．20±1．17、4．20±1．17和7．20±0．98，其中尾静脉注射组、泪腺注射组和点眼组小鼠角膜荧光素染色评分值明显低于模型组，差异均有统计学意义（P=0．001、0．000、0．033）。注射HUCMSCs后尾静脉注射组小鼠血清IL-6、IL-17a和TNF-α质量浓度均明显低于模型组，差异均有统计学意义（t=4．70、3．46、11．00，均P〈0．01），而各组间小鼠血清IFN-γ质量浓度总体比较差异无统计学意义（F=1．740，P=0．170）。尾静脉注射组和泪腺注射组小鼠眶外泪腺中Stat5蛋白相对表达量低于模型对照组，差异均有统计学意义（均P〈0．05）。结论NOD／Ltj干燥综合征模型小鼠全身和泪腺局部注射HUCMSCs能够分别抑制血清和泪腺中炎性相关因子的表达，减轻炎症反应，从而治疗干眼。HUCMSCs点眼法能够发挥润滑和营养角膜的作用，从而缓解干眼症状。

组织工程上皮移植治疗烧伤后部分角膜结膜化的初步观察

目的探讨组织工程上皮移植治疗眼表烧伤后因角膜缘干细胞功能障碍导致角膜结膜化的临床疗效。方法系列病例研究。选择2007年12月至2008年5月期间，在首都医科大学附属北京同仁医院、北京同仁眼科中心收治的6例（6只眼）因化学烧伤、热烧伤所致的角膜结膜化患者，采用组织工程上皮移植治疗，术后随访观察6～12个月，对患者的视力、角膜新生血管及角膜透明度进行评估。结果在随访期内，术后6例患者中有5例视力轻度提高，1例视力无变化。6例患者术后角膜新生血管较术前改善，但是在随访末期有1例患者术后新生血管再次长入角膜并大于1／2象限。5例患者的角膜透明度较术前提高。4例患者角膜基本透明，2例患者角膜轻度混浊。结论组织工程上皮移植治疗眼烧伤后角膜结膜化可改善眼表损伤程度。