检测戊型肝炎病毒核酸的实时荧光聚合酶链反应法的建立

目的建立一种能快速、敏感地检测戊型肝炎病毒(HEV)核酸的实时荧光聚合酶链反应法(Real-timeRT-PCR)。方法基于HEVORF3保守区序列,设计引物和探针,从22对引物和4条探针中进行筛选,并对选出的引物和探针的浓度、反应体系、反应条件、核酸抽提方法等进行优化。采用常规套式RT-PCR和本研究建立的实时荧光RT-PCR检测不同样品,比较两种方法的特异性和敏感性。结果优化出1对引物和探针的组合。优化的30μl反应体系中,上、下游引物浓度均为0.10mmol/L,探针浓度为0.20mmol/L,Taq酶的浓度为3U,AMV逆转录酶浓度为2U。优化的反应条件为:50℃30min;95℃3min;95℃10s,50℃30s,72℃60s,5个循环;95℃10s,57℃40s,40个循环。初步检测结果显示,该方法与常规套式RT-PCR特异性符合率为100%,两种方法检测HEV1型样品的敏感性均为104,检测人和猪的HEV4型样品时,实时荧光RT-PCR敏感性均为104,明显高于常规套式RT-PCR的103和102。结论所建立的检测HEV核酸的实时荧光聚合酶链反应法具有简便、快速、敏感性较高以及不易被污染等优点,具有一定的临床应用潜力。

戊型肝炎病毒各生物标志物之间关系分析

目的分析戊型肝炎病毒（HEV）各生物标志物之间关系以及各标志物在早期诊断中的作用。方法从临床收集急性散发性肝炎患者的血清，用酶联免疫（EIA）试剂检测HEV IgG抗体、IgM抗体和抗原，用实时荧光RT-PCR方法检测核酸，比较其相关关系。结果在121例急性散发性肝炎中，HEV IgM抗体阴性者为51例，其中抗原或／和核酸阳性者占45．1％；IgM抗体阳性者70份，其中抗原或／和核酸阳性者占67．1％。HEV IgG抗体在IgM抗体、抗原和核酸均阴性的患者中阳性率为53．6％；在IgM阴性而抗原或／和核酸阳性者中阳性率为73．9％；在IgM阳性的HEV感染者中阳性率为92．9％。HEV抗原与核酸的符合率为81．8％，抗原与IgM抗体的符合率为58．7％，而IgM抗体与核酸的符合率为53．7％。结论在HEV感染的早期诊断中增加抗原和核酸的检测有助于提高检出率。

实时荧光逆转录PCR检测戊型肝炎病毒RNA的临床应用

目的探讨实时荧光逆转录（RT）-PCR方法检测急性戊型肝炎患者血清戊型肝炎病毒（HEV）RNA的意义。方法采用实时荧光RT—PCR方法，对HEVORF3基因保守区进行扩增和检测。收集北京佑安医院住院和门诊434例急性戊型肝炎患者血清；甲型肝炎患者40例、乙型肝炎患者100例、健康献血员110名作为对照组；提取HEVRNA进行荧光RT—PCR检测。结果434例急性戊型肝炎患者血清中232例（53．5％）为HEVRNA阳性。对照组血清HEVRNA检测均为阴性。与血清抗-HEVIgM检测比较，434例急性戊型肝炎患者HEVRNA检测的总符合率为67．1％，两种检测方法差异有统计学意义（Kappa=0．308，P=0．000）。5例患者的首份血清检测为HEVRNA阳性，但抗．HEVIgM为阴性，系列追踪检测，相继出现抗-HEVIgM阳性。急性戊型肝炎患者的血清HEVRNA的检出多在发病的2～10d内。结论荧光lit—PCR方法有较高的特异性，应用实时荧光RT—PCR方法能对Ⅰ和Ⅳ戊型肝炎病毒感染的患者血清中的RNA进行定性检测。在临床使用可以提高对HEV早期诊断的水平。