复合透明质酸钠的硫酸钙可注射材料促进骨再生的实验研究

目的制备复合透明质酸钠的硫酸钙可注射材料,观察其促进骨再生作用,为骨缺损修复提供一种可注射材料。方法将硫酸钙分别与透明质酸钠溶液、交联透明质酸钠溶液、PBS溶液,按照2∶1(W/V)比例混合,制备3种复合材料(记作CA+HA、CA+HAC以及CA)。通过将3种复合材料浸泡于PBS溶液中观察其形变并进行X线衍射分析,观察材料稳定性。参照ISO10993-5制备3种复合材料浸提液,用于培养小鼠前成骨细胞(MC3T3-E1),并采用细胞增殖-毒性检测试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8)方法检测材料的生物相容性和不同浓度浸提液促进细胞增殖的能力,以单纯培养基培养细胞作为对照组。采用成骨分化培养基制作促进细胞增殖的最佳浓度浸提液,用于培养MC3T3-E1细胞,ELISA法检测成骨分化相关蛋白ALP、Ⅰ型胶原(collagen typeⅠ,COL-Ⅰ)及骨钙蛋白(osteocalcin,OCN)浓度。取新西兰大白兔制作股骨髁骨缺损模型,分别植入CA+HA、CA+HAC以及CA材料,于6、12周取标本行Micro-CT扫描并计算骨组织占组织体积百分比(bone volume/tissue volume,BV/TV),然后标本切片行HE染色,观察缺损区新骨形成情况。结果复合材料稳定性检测示,CA+HA及CA+HAC具有良好可注射性,在PBS溶液中不易溃散,优于CA。生物相容性实验显示,培养6、12、24 h,CA组吸光度(A)值均低于对照组(P<0.05);CA+HA组、CA+HAC组A值与对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。细胞增殖实验显示,25%、50%浓度浸提液培养5 d时CA组、CA+HA组和CA+HAC组A值均显著高于对照组(P<0.05);75%、100%浓度浸提液培养后,仅CA+HA组A值高于对照组(P<0.05)。选择50%浓度浸提液进行成骨分化实验。ELISA检测示,培养14、21 d时CA+HA组和CA+HAC组ALP、COL-Ⅰ、OCN浓度均显著高于对照组、CA组(P<0.05)。Micro-CT检查示,6、12周时CA+HA组、CA+HAC组间BV/TV差异无统计学意义(P>0.05),但均显著高于CA组(P<0.05);HE染色示,6周时CA组缺损处无成形骨组织,CA+HA组和CA+HAC组可见少量骨组织;12周时,CA组可见到少量细条索状骨组织形成,CA+HA组和CA+HAC组均见较多条索状骨组织,明显优于CA组,但两组间无显著差异。结论硫酸钙与透明质酸钠溶液及其交联产品按照2∶1(W/V)比例混合制备的复合材料具有稳定性和可注射性,体外能促进小鼠MC3T3-E1细胞增殖和分化,植入新西兰大白兔体内后具有良好成骨能力,有望作为一种可注射材料用于骨缺损微创治疗。