载奥沙利铂类弹性蛋白多肽水凝胶的制备及其对小鼠结肠癌CT26细胞的杀伤作用

目的:制备担载奥沙利铂(OXA)的类弹性蛋白多肽(ELPs)水凝胶,研究其体外药物释放情况及对小鼠结肠癌CT26细胞的杀伤作用。方法:利用大肠杆菌(E.coli)系统表达ELPs原核蛋白,利用可逆相变循环法(ITC)进行蛋白纯化,将ELPs蛋白溶液与交联剂四羟甲基氯化磷(THPC)混匀制备水凝胶,扫描电子显微镜(SEM)观察水凝胶的超微结构,CCK-8法检测不同浓度ELPs水凝胶处理后CT26细胞和小鼠成纤维NIH3T3细胞存活率,活/死细胞染色法观察30和40 g∙L-1 ELPs水凝胶作用48 h后CT26细胞存活情况。制备载OXA的ELPs水凝胶,检测其在不同pH值(6.5和7.4)缓冲液中的药物释放情况,CCK-8法检测加入载不同浓度(0.25、1.00、4.00、16.00和64.00 mg∙L-1)OXA的ELPs水凝胶浸泡液后各组CT26细胞存活率和处理不同时间各组CT26细胞存活率。结果:凝胶电泳分析,E.coli诱导后在预计相对分子质量38000附近出现明显加粗的蛋白条带,ITC纯化后泳道中无明显杂蛋白存在。ELPs蛋白溶液中加入THPC后由透明液体状态转变为不透明的白色水凝胶,SEM观察显示出排列整齐的孔隙和三维结构;CCK-8法检测,经不同浓度ELPs蛋白处理后CT26细胞和NIH3T3细胞存活率仍接近100%;活/死细胞染色,ELPs水凝胶处理后的CT26细胞在荧光显微镜下呈现明亮的绿色荧光。载OXA的ELPs水凝胶能在体外持续释放OXA,在pH值6.5条件下OXA的释放速度较pH值7.4条件下稍快;CCK-8法检测,载不同浓度OXA的ELPs水凝胶浸泡液呈剂量依赖性抑制CT26细胞增殖,且随孵育时间的延长CT26细胞存活率逐渐降低。结论:载OXA的ELPs水凝胶具有持续释放OXA的特性,能够高效且持续地杀伤小鼠结肠癌CT26细胞,可作为一种安全有效的药物递送载体用于抗肿瘤研究。

LAG3慢病毒质粒构建及其稳定转染细胞系的建立

目的:构建淋巴细胞活化因子3(LAG3)-mCherry红色荧光蛋白的LAG3-mCherry慢病毒表达载体,转染HEK293T细胞获得稳定表达LAG3-mCherry融合蛋白的细胞系,探讨LAG3-mCherry融合蛋白在HEK293T细胞中的定位。方法:将LAG3质粒和带有mCherry的慢病毒载体分别用限制性内切酶EcoRⅠ和NotⅠ进行双酶切,构建pEZ-LAG3-mCherry表达载体。将测序正确的质粒利用Lipofectamine 3000转染HEK293T细胞,利用荧光显微镜观察LAG3-mCherry在HEK293T细胞中的表达定位,Western blotting法检测LAG3-mCherry融合蛋白的表达情况。结果:酶切鉴定结果,电泳后重组质粒双酶切后可见约为8012和2066 bp大小的2条DNA条带,与pEZ-Lv-mCherry载体及LAG3基因片段大小相符;DNA测序结果,LAG3基因成功插入到慢病毒表达载体中。荧光显微镜观察,LAG3-mCherry融合蛋白主要在HEK293T细胞膜上表达,少量蛋白滞留在细胞质中。Western blotting法检测,在转染pEZ-LAG3-mCherry质粒中检测到LAG3对应特异性条带。结论:成功构建了LAG3-mCherry慢病毒表达载体pEZ-LAG3-mCherry。通过稳定转染成功制备了稳定表达LAG3-mCherry的细胞系。LAG3-mCherry融合蛋白主要分布于HEK293T细胞的细胞膜上。

免疫检查点TIGIT慢病毒表达载体的构建和稳定表达TIGIT细胞系的建立

目的:构建T细胞免疫球蛋白和免疫受体酪氨酸抑制基序结构域-绿色荧光蛋白(TIGITGFP)慢病毒表达载体,建立稳定表达TIGIT-GFP的细胞系,探讨TIGIT-GFP融合蛋白在稳定表达细胞系中的表达情况。方法:将TIGIT质粒和慢病毒载体pLenti-GFP分别采用限制性内切酶EcoRⅠ和NotⅠ双酶切,凝胶回收后连接构建重组质粒pLenti-TIGIT-GFP。将测序正确的重组质粒转染人胚胎肾HEK293T细胞作为实验组,转染TIGIT质粒的HEK293T细胞作为对照组,转染48 h后荧光显微镜下观察细胞膜上GFP表达情况。将实验组细胞继续培养,采用嘌呤霉素筛选2周后,挑取单克隆扩大培养,荧光显微镜观察细胞膜上GFP表达情况,Western blotting法检测在转染的人胚胎肾HEK293T细胞中TIGIT-GFP蛋白表达情况。结果:酶切鉴定,TIGIT基因成功插入pLenti-GFP表达载体,DNA测序未检测到突变发生。实验组细胞膜上检测到GFP表达。Western blotting法检测,实验组细胞裂解液中检测到TIGIT-GFP特异性条带。结论:成功构建pLenti-TIGIT-GFP慢病毒表达载体,建立稳定表达TIGIT-GFP融合蛋白的细胞系,TIGIT-GFP融合蛋白主要在稳定细胞系的细胞膜上表达。

载奥沙利铂细胞膜囊泡纳米药物的制备及其对小鼠结肠癌细胞的杀伤作用

目的:制备内腔担载奥沙利铂(OXA)的细胞膜纳米囊泡(NVs),得到纳米药物NVs@OXA,探讨NVs@OXA对小鼠结肠癌细胞的内吞和杀伤效应。方法:利用超速离心法分离HEK-293T细胞的细胞膜,通过脂质体挤出仪制备NVs,动态光散射检测NVs粒径,透射电子显微镜下观察NVs的超微结构。检测含有不同浓度(5、10、20、50、75和100 mg·L-1)NVs作用后小鼠树突状DC2.4细胞的存活率。激光共聚焦荧光显微镜成像分析囊泡的细胞内吞情况。采用电击法或孵育法将OXA装载于囊泡内腔,获得纳米药物NVs@OXA。检测纳米药物NVs@OXA的装载效率和粒径变化。以游离OXA(游离OXA组)作为对照,MTT法检测含有不同浓度(1.0、2.5、5.0、10.0和15.0μmol·L-1)NVs@OXA(NVs@OXA组)结肠癌CT26细胞的存活率,流式细胞术检测各组小鼠结肠癌CT26细胞凋亡率。结果:采用细胞膜制备平均粒径为222.2 nm的NVs。细胞相容性检测,所有NVs处理的小鼠树突状DC2.4细胞存活率均>100%;电击法制备的OXA装载效率高于孵育法;纳米药物制备12 d内OXA粒径尺寸未见明显变化;激光共聚焦荧光显微镜下,NVs@OXA能成功进入结肠癌CT26细胞内;MTT法检测,在OXA浓度为10和15μmol·L-1时,NVs@OXA组结肠癌细胞的存活率低于游离OXA组(P<0.05)。流式细胞术检测,NVs@OXA组结肠癌CT26细胞凋亡率高于游离NVs组(P<0.05)。结论:利用NVs成功制备了内腔载有OXA的纳米药物NVs@OXA,电击法较孵育法制备的OXA装载效率更高,纳米药物可以被CT26结肠癌细胞高效内吞;纳米药物具有较游离OXA更强的肿瘤杀伤作用。

肿瘤归巢肽-近红外荧光蛋白融合蛋白的制备及其荧光特性

目的:构建肿瘤归巢肽(THPs)-近红外荧光蛋白(NIRFP)miRFP670-LyP1融合蛋白的原核表达载体,纯化融合蛋白,研究融合蛋白的近红外荧光特性。方法:采用限制性核酸内切酶EcoRⅠ和NotⅠ对pmiRFP670-N1质粒和pET-28a质粒进行双酶切,构建pET-miRFP670原核表达载体,通过点突变引入LyP-1的DNA序列,构建重组表达载体pET-miRFP670-LyP1;将测序正确的重组表达载体转化至大肠杆菌BL21细胞中,SDS-PAGE电泳法检测不同温度(16℃和37℃)、不同异丙基硫代半乳糖苷浓度(0.1、0.5和1.0 mmol·L^(-1))诱导下融合蛋白原核表达量;采用Ni-NTA树脂亲和纯化融合蛋白,检测miRFP670-LyP1蛋白原核表达量;采用荧光显微镜观察乳腺癌4T1细胞中miRFP670-LyP1融合蛋白的细胞内吞形态表现。结果:检测到长度约为5343和973 bp的DNA条带,与pET-28a载体及miRFP670基因片段大小相符。DNA测序,LyP1序列成功插入至pETmiRFP670表达载体中。在16℃时miRFP670-LyP1融合蛋白的可溶性蛋白表达量较37℃时更高。采用Ni-NTA树脂纯化得到了高纯度的miRFP670-LyP1融合蛋白。荧光成像,miRFP670-LyP1融合蛋白可被乳腺癌4T1细胞高效内吞。结论:成功构建了pET-miRFP670-LyP1原核表达载体,融合蛋白在低温(16℃)较常温(37℃)诱导的可溶性蛋白表达量更高,亲和层析得到了高纯度的融合蛋白,融合蛋白被乳腺癌4T1细胞高效内吞并显示出近红外荧光。