诱导性表达Cre重组酶转基因载体的构建及鉴定

背景:猪在遗传上与人类相似,因此猪是研究人类疾病最好的动物模型,而对于这方面的研究在国内外报道较少。目的:建立诱导性表达Cre重组酶的转基因载体。设计、时间及地点:单一样本观察,于2007-10/2008-05在吉林大学农学部畜牧兽医学院完成。材料:DH5a菌株E.coliDH5α,质粒pcDNA3.1(+)、PET28a(+)、pCIneo,重组质粒PMD-Cre和猪成纤维细胞由北华大学医学部基础医学院细胞生物教研室保存;重组质粒pGC-FRT2NeoRRRR和Mx1克隆载体pGL3-Mx1由意大利Stefano教授馈赠。方法:构建的载体包括以下元件:Mx1启动子用来启动Cre的表达,Cre的作用是工具便于以后做基因敲除,BGHpolyA是一个终止信号,FRT2NeoR中的FRT是FLP酶的识别位点便于切除筛选标记,NeoR是筛选标记。通过聚合酶链反应方法分别从pGL3Mx1载体上和pcDNA3.1(+)载体上扩增猪Mx1启动子和BGHpolyA。利用重叠聚合酶链反应方法获得猪源的Cre重组酶基因,并从pGCFRT2NeoR上用XholⅠandSalⅠ酶切得到FRT2NeoR盒子。将上述4个片段利用SOE-PCR及酶连接的方法用T4DNA连接酶连接,然后利用原核表达载体PET28a(+)构建出Cre表达载体Mx1-Cre-BGHpolyA-FRT2neoR。主要观察指标:Cre重组酶表载体PET28a(+)-Mx1-Cre-BGHpolyA-FRT2neoR的鉴定。结果:PET28a(+)-Mx1-Cre-BGHpolyA-FRT2neoR重组质粒经NheⅠ和NotⅠ双酶切后完全符合理论上可切出的大小片段,载体构建成功。结论:成功的构建了诱导性表达Cre重组酶表达载体Mx1-Cre-BGHpolyA-FRT2neoR。