基础医学科研团队建设与管理模式探讨

现代医学的发展随着生物工程、计算机网络等现代科技的蓬勃发展而日新月异,传统的各门类学科研究也进入到相互依托、交叉融合和综合演变的阶段,医学的发展也由单一线性发展模式向结构式的网络发展[1]。在此背景下,客观上要求科研人员必须放弃＂闭门修行＂的科研思维方式而积极开展团队合作研究,通过不断整合各方面科技资源、形成合力来完成研究目标。

C2神经酰胺对帕金森病模型鼠多巴胺能神经元的保护作用

背景:C2神经酰胺可减少Alpha突触核蛋白(Alpha-Synuclein,α-Syn)寡聚体的形成,其作为蛋白磷酸酶2A激动剂在中枢神经系统对细胞老化具有重要调节作用。目的:探究C2神经酰胺对多巴胺能神经元的保护作用机制。方法:将25只C57BL/6系小鼠随机分为对照组、模型组及C2神经酰胺低、中、高剂量组,每组5只。除对照组之外,其他各组均通过左侧纹状体注射突变型A53Tα-Syn寡聚体建立帕金森病小鼠模型,在纹状体注射第30天后,3个C2神经酰胺各剂量组小鼠一次性经胃灌注溶于生理盐水中的各剂量C2神经酰胺(1,5,10μg/g),对照组及模型组同法灌注等量生理盐水,于造模后第30-90天,连续每天给药,共60 d,期间观察各组小鼠行为学变化。在纹状体注射第90天后,在适度麻醉条件下对各组小鼠灌注取脑,以免疫组织化学染色分析小鼠中脑黑质多巴胺能神经元的变化,以ELISA法检测小鼠中脑α-Syn寡聚化和磷酸化水平,并分析影响α-Syn磷酸化的相关酶活性变化。结果与结论:①C2神经酰胺对经纹状体注射的突变型A53Tα-Syn寡聚体所导致的小鼠帕金森病样运动障碍具有改善作用,且C2神经酰胺高剂量组对帕金森病模型鼠运动障碍的改善作用更为明显(P<0.01);②突变型A53Tα-Syn寡聚体致使小鼠中脑黑质多巴胺能神经元数目明显减少(P<0.01),而C2神经酰胺高剂量组黑质多巴胺能神经元数目则明显增多(P<0.01);③与模型组相比,C2神经酰胺高剂量组小鼠中脑内α-Syn寡聚体和磷酸化α-Syn水平明显降低(P<0.01),而神经酰胺的水平增高(P<0.05),蛋白磷酸酶2A活力明显上调(P<0.01);④上述数据说明,C2神经酰胺可通过改善小鼠中脑组织α-Syn的磷酸化修饰环境,缓解了由寡聚的α-Syn所诱导的神经毒性作用,保护了小鼠中脑黑质多巴胺能神经元数量的减少,从而减轻帕金森病的运动障碍程度。

α-突触核蛋白的异常修饰及在帕金森病中的作用机制

背景:因α-突触核蛋白异常聚集而形成的路易体是帕金森病特征性病理变化。近年多项研究揭示α-突触核蛋白聚集体的形成与其翻译后修饰关系密切。α-突触核蛋白的磷酸化、硝基化、乙酰化、泛素化等修饰在帕金森病的发病和进展中的作用得到广泛关注。目的:通过文献综述的方法阐述关于α-突触核蛋白修饰类型、修饰位点对帕金森病的特征性病理形成和进展的影响。方法:由第一作者系统检索中国知网和PubMed数据库,以“α-突触核蛋白,帕金森病,磷酸化,乙酰化,泛素化,硝基化”为中文检索词,以“α-Synuclein,Parkinson’s disease,phosphorylation,acetylation,ubiquitination,nitration”为英文检索词,收集整理近年来与α-突触核蛋白异常修饰相关的文献,最终纳入61篇文献进行综述分析。结果与结论:①α-突触核蛋白异常修饰与其蛋白结构和其带有正负电荷密切相关,其氨基端带有正电荷,易发生泛素化和乙酰化修饰;其中心疏水区域因其疏水特性易形成β片层结构,其羧基端带有负电荷,是主要磷酸化修饰区域。②磷酸化修饰位点可促进磷酸化修饰并与α-突触核蛋白的聚集密切相关,而蛋白激酶可靶向激活翻译修饰,可能有助于促进或抑制聚集体形成。③α-突触核蛋白的降解途径主要发挥清除病理性蛋白的作用,各种激酶催化促使蛋白泛素化修饰后,使其功能受损,导致蛋白异常堆积,从而加重神经退变。④α-突触核蛋白的氨基端经过乙酰化修饰后,可提升蛋白对细胞膜的穿梭能力,减缓蛋白聚集,可能为神经细胞保护靶点,但是在突变型蛋白发生乙酰化修饰后反而产生相反作用。⑤α-突触核蛋白的硝基化修饰主要与氧化应激相关,在活性氧的作用下,硝基化修饰的蛋白聚集倾向增强。⑥由于α-突触核蛋白不同翻译后修饰产生的影响各异,因此阐明其翻译后修饰的主要机制,抑制促使蛋白聚集的翻译后修饰,可能为帕金森病早期诊断和治疗提供新靶点参考。

α-突触核蛋白在帕金森病患者血清中的磷酸化修饰

背景:α-突触核蛋白翻译后修饰后形成的聚集体是帕金森病主要的病理学改变。α-突触核蛋白可通过血脑屏障由中枢进入外周血分布至机体各部,这成为帕金森病病理播散的重要途径。因此研究血液中的α-突触核蛋白变化对揭示帕金森病的机制以及早期诊断尤为重要。目的:拟分析α-突触核蛋白在帕金森病患者血清中的磷酸化修饰位点及生成聚集体间的结构稳定性的差异。方法:构建重组人α-突触核蛋白原核表达系统,亲和层析法纯化蛋白,采用SDS-PAGE电泳和Western blot方法检测α-突触核蛋白单体纯度和特异性。收集北华大学附属医院神经内科住院的26例帕金森病患者血清和26例正常人血清,完成各组血清中α-突触核蛋白聚集体的制备;采用质谱SWATH方法检测帕金森病患者血清中α-突触核蛋白发生磷酸化修饰的修饰位点,并对不同位点的蛋白聚集体进行定量分析。将不同磷酸化修饰的蛋白聚集体免疫亲和层析法纯化后,Western blot方法检测帕金森病患者血清中各磷酸化修饰后聚集体的稳定性。结果与结论:①实验通过SDS电泳和Western blot方法检测显示得到纯度较高、特异性较高的α-突触核蛋白单体。②质谱SWATH分析结果显示,在帕金森病患者和正常人血清中均发生磷酸化修饰,其中帕金森病患者血清中磷酸化修饰的位点明显多于正常人,帕金森病患者血清中发生磷酸化的位点有丝氨酸(Serine,Ser)87、Ser129、酪氨酸(L-tyrosine,Tyr)125、Tyr133和Tyr136等。③帕金森病患者血清中孵育后的α-突触核蛋白中,Ser129位点磷酸化修饰占总磷酸化的53.65%,Tyr125,Tyr133,Tyr136和Ser87磷酸化各为17.21%,15.79%,15.79%,9.52%和1.03%。④Western blot检测结果显示,帕金森病患者血清中Ser129位点磷酸化修饰后形成的聚集体较Tyr125,Tyr133和Tyr136更为稳定。⑤上述数据证实,帕金森病患者血清中的α-突触核蛋白磷酸化修饰位点数量明显多于正常人;在诸多修饰位点中,血清α-突触核蛋白的Ser129位点经过磷酸化修饰后形成的聚集体最稳定,这可能为帕金森病早期诊断提供诊断标志物参考。

微管蛋白和微管作用物质研究及其在神经退行性疾病中的机制探讨

背景:tau蛋白是一种微管相关蛋白。研究表明,变异的tau蛋白被认为是阿尔茨海默病患者产生老年斑的关键;人突触核蛋白(Syn)是参与形成帕金森病患者淀粉样变性的主要成分。目的:总结近年来微管相关作用物质的研究进展及其与神经退行性疾病的相关性。方法:以"tubulin;Alzheimer Disease;Parkinson Disease;Neurodegeneration:微管蛋白;神经退行性疾病;阿尔茨海默病;帕金森病"为检索词,检索1975年3月至2014年3月Pub Med数据库及万方医学网相关文献。纳入微管结构与功能、微管与神经退行性疾病相关蛋白、微管蛋白相关物质及其与神经退行性疾病相关研究的文献26篇进行分析探讨。结果与结论:微管由微管蛋白组成,在细胞中起重要的细胞骨架作用。在神经系统,微管系统的稳定性也是维持胞体和突起间营养转运的基础。已证实微管蛋白与帕金森病、阿尔茨海默病等神经退行性疾病的关键蛋白密切相关。tau蛋白异常聚积导致的轴突转运障碍不仅影响神经元的形态,而且影响其功能。Syn可以促进生长初期原代培养神经元轴突内微管的组装。当细胞受到不良刺激时,发生微管相关物质的不良代谢,导致微管系统产生结构的紊乱和功能的障碍,胞内物质异常堆积,并通过一系列目前尚待阐明的调控机制使细胞逃逸凋亡,从而进入退行性变性。目前的神经退行性疾病的临床治疗也多以替代法治疗为主,尚无特效药物。

家族型帕金森病α-突触核蛋白突变体寡聚化对神经元毒性的影响

目的观察家族型帕金森病（PD）α-突触核蛋白（α-Syn）突变体A53T和A30P聚集体对大鼠原代神经元的神经毒性。方法取大鼠前脑皮质神经元进行原代培养,在培养基中加入体外孵育的α-Syn聚集体。培养14 d后,MTT法和神经元流式细胞术观察神经元的细胞活力。免疫荧光染色后以激光共聚焦显微镜观察细胞内聚集体的分布。硫磺素S染色观察细胞内包涵体的形成。结果加入α-Syn聚集体各组的原代神经元细胞活力较对照组降低（P〈0.05）,而加入突变体A53T和A30P聚集体的原代神经元细胞活力比对照组明显降低（P〈0.01）;突变体A53T和A30P聚集体的原代神经元细胞活力下降较野生型α-Syn聚集体显著（P〈0.05）。突变体A53T和A30P聚集体对神经元的毒性作用,在1~14 d内随培养时间而增加（P〈0.05）;在1~10μmol/L浓度范围内,随浓度的增加而毒性增加（P〈0.05）。突变体A53T和A30P聚集体可以进入原代神经元内,并可在细胞内聚集而形成硫磺素S染色阳性的斑块。结论家族型α-Syn突变体A53T和A30P聚集体对原代神经元具有神经毒性,此作用具有时间和剂量依赖关系。这一现象对阐明家族型PD的发病机制具有重要意义。

Alpha-突触核蛋白寡聚体致帕金森病小鼠模型的行为学变化

目的观察家族型帕金森病(PD)alpha-突触核蛋白(α-Syn)突变体A53T和A30P寡聚体导致小鼠PD模型的行为学变化,探讨α-Syn寡聚体在体内的神经毒性作用。方法制备野生型α-Syn、家族型突变体A53T和A30P的聚集体,对C57BL/6小鼠进行纹状体注射。培养至第30、60天,进行爬杆实验、悬吊实验、滚轴实验和平衡木实验评估行为学改变。免疫组织化学方法检测黑质多巴胺能神经元改变。结果实验鼠纹状体α-Syn寡聚体注射后30 d出现PD样运动障碍表现,纹状体注射30 d和60 d后,各组小鼠的爬杆实验结果均与对照组无差异(P>0.05)。注射30 d后,野生型α-Syn寡聚体组小鼠平衡木实验、悬挂实验、滚轴实验与对照组无差异(P>0.05);A53T和A30P组小鼠平衡木时间比对照组长(P<0.05),滚轴上时间比对照组小鼠缩短(P<0.05),悬挂评分比对照组明显降低(P<0.01),与野生型α-Syn寡聚体组相比有统计学差异(P<0.05)。注射60 d后,野生型α-Syn寡聚体组小鼠平衡木实验平均通过时间比对照组小鼠长(P<0.05)、悬挂实验评分较对照组小鼠降低(P<0.05);A53T和A30P组小鼠各项行为学评估与对照组小鼠差异显著(P<0.01)、与野生型α-Syn寡聚体组相比有差异(P<0.05)。A53T和A30P组小鼠黑质多巴胺能神经元数目下降(P<0.05)。结论纹状体注射α-Syn突变体A53T和A30P寡聚体,模型小鼠出现PD样行为学改变和黑质多巴胺能神经元减少。

α-突触核蛋白寡聚体抑制大鼠原代培养神经元突起早期生长

目的观察人α-突触核蛋白(α-synuclein,α-Syn)和其形成的寡聚体对大鼠原代培养神经元突起生长的影响,明确α-Syn的生理功能,探讨其寡聚化对神经元的毒性及其在帕金森病发病机制中的作用。方法制备α-Syn的寡聚体,向分组培养的大鼠脑皮质神经元培养基中添加,培养1、2和4 h后固定,观察对神经元突起生长的影响。神经元的突起以成像显微镜观察测量,Western blotting法、免疫荧光法实验进行鉴定。结果添加α-Syn寡聚体组的神经元培养至1、2和4 h时,其突起的平均长度均小于对照组和添加α-Syn单体组(P<0.05)。增加α-Syn寡聚体浓度,随浓度增高神经元突起的平均长度与对照组差异越大(P<0.01)。Western blotting法和免疫荧光实验明确了外源性α-Syn寡聚体可以从培养基进入到神经元内。结论α-Syn寡聚体在原代神经元生长初期对其突起生长具有抑制作用,这一现象可能与其在帕金森病发病机制中的作用有关。

腹腔干及分支特殊变异1例

在解剖一具50岁老年男尸时，观察发现腹腔干及其分支有特殊变异，为积累资料及为临床提供参考，现报道如下： 变异腹腔干在第12胸椎前方由腹主动脉前壁发出向左行，外径9．9mm，长1．70cm，分为脾动脉和两支胃左动脉（图1A）。其中脾动脉的走行和分布与正常无异。

立体定向脑图谱基准点的测定及其意义

目的对立体定向脑图谱的基准点进行测定研究,为构建临床立体定向脑手术提供基础。方法在立体定向空间坐标系内,应用MR扫描图像处理技术对120例健康自愿者和应用解剖学技术对30例尸脑分别进行脑内基准点前连合(AC)、后连合(PC)的径值和前后连合间距(ICD)进行测量。结果在立体定向空间内,无论在大体标本,还是在MR图像上,AC、PC均清晰可见;在尸脑上测得AC的前后径为(2.75±0.76)mm,上下径为(3.85±0.68)mm,PC的前后径为(1.87±0.58)mm,上下径为(2.48±0.64)mm,ICD长度为(22.68±1.46)mm;在健康自愿者测得AC的前后径为(2.80±0.32)mm,上下径为(3.82±0.37)mm,PC的前后径为(1.76±0.30)mm,上下径为(2.30±0.45)mm,ICD长度为(23.84±1.32)mm。结论通过尸脑与健康正常人脑的对比测量研究,在立体定向坐标系内脑内AC、PC是脑内准确定位的基准点,AC-PC是恒定的参考线。

突变型α-突触核蛋白对大鼠原代培养神经元突起生长作用研究

目的观察人α-突触核蛋白(α-synuclein,α-Syn)和其突变体A30P和A53T对大鼠原代培养神经元突起生长的影响,明确α-Syn的生理功能,揭示突变体A30P和A53T在帕金森病的发病机制中的作用。方法取大鼠大脑皮质神经元分组培养,在细胞外添加A30P、A53T和α-Syn,培养1 h、2 h和4 h后固定,比较A30P、A53T与α-Syn对神经元突起生长的影响。神经元突起以成像显微镜观察测量,Western blotting法、免疫荧光法、单克隆抗体阻断实验鉴定各蛋白作用的特异性。结果添加α-Syn组的神经元培养至1、2和4 h时,其突起的平均长度大于对照组和添加A30P、A53T组(P<0.05)。A30P、A53T组和对照组的神经元突起长度差异无统计学意义(P>0.05)。增加蛋白的含量,浓度越高,α-Syn组神经元突起的平均长度与添加A30P和A53T组差异越大(P<0.01)。Western blotting和免疫荧光实验明确了外源性α-Syn可以从培养基进入到神经元内,并均匀分布在胞体和突起。而A30P和A53T组,并未发现。结论α-Syn在原代神经元生长初期对其突起生长具有促进作用,突变体A30P和A53T,无促神经元突起生长作用,这一现象可能与其在帕金森病发病机制中的作用有关。

α-突触核蛋白功能片段对原代培养大鼠神经元突起的促生长作用

目的:研究人α-突触核蛋白(α-Syn)对原代培养大鼠神经元突起的促生长作用,阐明该蛋白质的功能片段,并探讨其作用机制。方法:获取新生Wistar大鼠大脑皮层神经元分组培养,分别加入α-Syn(添加α-Syn组)、α-Syn功能片段N端(添加N端组)、C端(添加C端组)和NAC段(添加NAC段组),对照组不添加功能片段。倒置相差显微镜观察各组神经元突起的长度,Western blotting法、免疫荧光法特异性鉴定各组α-Syn蛋白的表达水平。结果:在生长至1和2h,添加C端组和α-Syn组的神经元突起平均长度长于对照组(P<0.05),而添加NAC段组和N端组与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05);生长至4h,添加α-Syn组和C端组的神经元突起平均长度明显长于对照组(P<0.01),而添加NAC段组和N端组与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。Western blotting和免疫荧光法检测,N端和C端可以进入神经元,NAC段不能进入神经元。结论:α-Syn在原代神经元生长初期对其突起生长具有促进作用,具有这一功能的片段位于C端,其机制可能是其通过胞膜进入到神经元内,促进微管蛋白聚合形成微管,加速细胞骨架的形成和轴浆转运。

内质网应激PERK-eIF2α-ATF4信号通路在延缓APP/PS1小鼠移植瘤生长中的作用

目的:探讨内质网应激(ERS)及内质网自噬对移植黑色素瘤模型淀粉样蛋白前体蛋白(APP)/早老素1(PS1)小鼠移植瘤生长的抑制作用,并阐明蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)-真核翻译起始因子2α(eIF2α)-活化转录因子4(ATF4)通路在其抑制作用中的可能机制。方法:体外培养B16细胞,通过皮下注射分别植入C57和APP/PS1小鼠背部皮下,建立C57BL/6J和APP/PS1雄性小鼠移植黑色素瘤模型,作为C57移植瘤组(n=7)和APP/PS1移植瘤组(n=7)。观察2组小鼠出瘤时间并计算肿瘤体积,实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测2组小鼠移植瘤组织中葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、PERK和溶酶体组织蛋白酶L(cathepsin L)mRNA表达水平,Western blotting法检测2组小鼠移植瘤组织中GRP78、PERK、磷酸化PERK(p-PERK)、真核翻译起始因子2α(eIF2α)、磷酸化eIF2α(p-eIF2α)、活化转录因子4(ATF4)和内质网自噬标志蛋白FAM134B蛋白表达水平,免疫组织化学法检测移植瘤组织中蛋白质二硫异构酶(PDI)蛋白表达情况,免疫荧光法测定2组小鼠移植瘤组织中腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)水平。结果:与C57移植瘤组比较,APP/PS1移植瘤组小鼠出瘤时间晚,肿瘤体积小(P<0.05),移植瘤组织中ERS相关基因GRP78和PERK mRNA表达水平升高(P<0.05),移植瘤组织中GRP78、p-eIF2α/eIF2α和ATF4蛋白表达水平及p-PERK/PERK比值均升高(P<0.05)。C57移植瘤组肿瘤细胞胞质内多见黑色素颗粒,为移植瘤组织的形态特征,可见少量棕黄色颗粒,为PDI阳性颗粒;APP/PS1移植瘤组肿瘤细胞胞质内可见少量黑色素颗粒和广泛表达的棕黄色颗粒。与C57移植瘤组比较,APP/PS1移植瘤组小鼠移植瘤组织中内质网自噬标志蛋白FAM 134B蛋白表达水平升高(P<0.05),cathepsin L mRNA表达水平升高(P<0.05),ATP水平降低(P<0.05)。结论:APP/PS1移植瘤模型小鼠肿瘤生长缓慢,其机制可能与ERS的PERK-eIF2α-ATF4信号通路被激活有关。

α-突触核蛋白功能片段对大鼠原代培养神经元的促生长作用

目的研究α-突触核蛋白(α-Syn)对Wistar大鼠原代培养神经元的促生长作用。方法培养新生24 h的Wistar大鼠大脑皮质神经元,以一定密度接种至培养皿中。设计分组,在各组别培养基中加入α-Syn和它的功能片段NAC段、N端和C端。培养至1、2、4 h固定观察,计数存活神经元的数目。Western印迹法、免疫荧光法进行特异性鉴定。结果当原代神经元培养至第1、2小时,α-Syn组和C端组的神经元数目比对照组多(P<0.05),N端组和NAC段组与对照组无差异(P>0.05);培养至第4小时,α-Syn组和C端组的存活神经元数目比对照组明显增多(P<0.01),而N端组和NAC段组与对照组无差异(P>0.05)。增加C端浓度,可以提高神经元的存活率(P<0.05)。Western印迹法和免疫荧光法证实蛋白质片段N端和C端可由培养基进入到原代神经元中,而NAC片段不能进入神经元。结论α-Syn在原代神经元培养初期对其生长有促进作用,具有这一功能的蛋白片段为C端,其可能的机制是进入到神经元内,促进胞内代谢活动,从而利于神经元的生长。

兔脑组织三种染色方法的比较

目的通过Nissl染色、苏木素伊红(HE)染色和Nissl-HE联合染色方法观察兔脑组织结构。方法分别对同一新鲜兔脑组织进行Nissl染色、HE染色和Nissl-HE联合染色。结果 Nissl染色易于观察神经元细胞的尼氏体形态;HE染色方便观察神经组织形态结构的轮廓;Nissl-HE联合染色后神经元细胞细胞核蓝染、细胞质粉染,尼氏体呈虎斑状蓝染,均清晰可见,易于观察、分辨。结论应用Nissl-H-E联合染色能够清晰地分辨出神经元细胞的细胞核、细胞质和尼氏体等形态结构。