香港牡蛎cyclin B基因组织表达特征及其多克隆抗体制备

【目的】明确香港牡蛎(Crassostrea hongkongensis)B型细胞周期蛋白基因(cyclin B)组织表达特征,并通过原核表达融合蛋白制备多克隆抗体,为探究香港牡蛎cyclin B基因在环境胁迫下的表达特征及揭示cyclin B调控贝类细胞周期的作用机制提供理论依据。【方法】克隆香港牡蛎cyclinB基因c DNA序列,通过SignalP-5.0、ProtParam、TMHMM2.0、NetSurfP2.0及Bioedit7.0等软件进行生物信息学分析,采用实时荧光定量PCR检测cyclinB基因在香港牡蛎不同组织中的表达情况;构建重组质粒pET32a-cyclin B并运用原核表达系统诱导表达融合蛋白,经Ni-NTA镍离子亲和层析柱纯化后免疫BALB/c小鼠制备鼠源多克隆抗体,然后以间接ELISA检测多克隆抗体效价、Western blotting检测多克隆抗体特异性。【结果】香港牡蛎cyclinB基因cDNA序列全长2353bp,包括1299bp的开放阅读框(ORF)、103 bp的5’非编码区(5’-UTR)和951 bp的3’非编码区(3’-UTR),共编码432个氨基酸残基。香港牡蛎cyclin B蛋白相对分子量为49.13 kD,理论等电点为7.16,不含信号肽和跨膜结构域。香港牡蛎cyclin B氨基酸序列包含2个保守的周期蛋白框,与来自同属的长牡蛎cyclin B氨基酸序列相似性最高(98.8%),基于cyclin B氨基酸序列相似性构建的系统发育进化树也显示香港牡蛎与长牡蛎的亲缘关系最近。cyclin B基因在香港牡蛎的闭壳肌、外套膜、性腺、鳃、唇瓣、消化腺等组织中均有表达,以性腺中的相对表达量最高,显著高于其他组织中的相对表达量(P<0.05)。通过原核表达获得的融合蛋白cyclin B具备良好免疫原性,且主要以包涵体形式存在;以其免疫BALB/c小鼠制备出的鼠源多克隆抗体效价大于1∶64000,能特异识别香港牡蛎性腺中的cyclin B蛋白。【结论】香港牡蛎cyclin B基因具有较高的保守性,其氨基酸序列包含2个保守的周期蛋白框;香港牡蛎cyclin B基因表达具有广谱性和组织差异性,在调控生殖细胞减数分裂过程中发挥作用。通过原核表达体系及免疫注射BALB/c小鼠制备获得的cyclin B鼠源多克隆抗体具有高效价,能特异识别香港牡蛎性腺中的cyclin B蛋白,为进一步探究香港牡蛎cyclin B的生物学功能与表达调控机理提供了技术支持。