人端粒酶逆转录酶真核表达质粒转染人成纤维细胞的体外培养及生物学特性研究

目的 分析人端粒酶逆转录酶 (h TERT)真核表达质粒 p GRN14 5转染人成纤维细胞的生物学特性。方法 体外分离培养小儿包皮成纤维细胞 ,脂质体法将构建的 p GRN14 5转染人成纤维细胞 ,经潮霉素 B筛选 ,扩增培养阳性克隆。 RT- PCR法、TRAP- PCR法分析细胞端粒酶活性。流式细胞术检测细胞增殖周期及细胞凋亡率 ,对转染后细胞行染色体核型分析及免疫组织化学法检测胶原分泌能力。结果 转染后培养的人成纤维细胞形态与转染前相比无明显改变 ,转染细胞稳定地表达端粒酶活性 ,流式细胞术分析转染前后成纤维细胞的增殖周期无明显改变 ,细胞凋亡率较转染前降低。经 p GRN14 5转染的人成纤维细胞保持正常的二倍体核型 ,具有正常分泌 、 型胶原的能力。结论 p GRN14 5转染的人成纤维细胞稳定地表达端粒酶活性 ,细胞寿命明显延长。

分子生物学与口腔医学的现状和未来

分子生物学与口腔医学的现状和未来陈谦明，傅继梁，李秉琦在过去近３０年里，生命科学领域取得了革命性的进步，这种进步的首要推动力来自分子生物学的兴起和发展。从１９４４年Ａｖｅｒｙ等确立ＤＮＡ是遗传信息的载体，到１９５３年Ｗａｓｔｏｎ和Ｃｒｉｃｋ创立ｎＮＡ...

花椒挥发油对实验性动脉粥样硬化的影响

目的观察中药花椒挥发油对豚鼠实验性主动脉粥样硬化形成的影响并探讨其可能的作用机制。方法将36只豚鼠随机分为正常对照组、模型组、花椒挥发油组;分别给予普通饲料(正常对照组)和高脂饲料(模型组和花椒挥发油组)喂养,花椒挥发油组动物在喂高脂饲料的同时,加喂花椒挥发油10mg/kg。喂养第14周末取血样后,处死所有动物,检测血清脂质、载脂蛋白水平、血清丙二醛含量、肝脏和主动脉组织中总胆固醇和甘油三酯含量以及主动脉粥样硬化斑块面积。结果高脂饲料喂养14周后,模型组和花椒挥发油组动物血脂水平均升高,且伴有主动脉粥样硬化斑块的形成;与模型组相比,花椒挥发油组动物血中低密度脂蛋白、低密度脂蛋白/高密度脂蛋白的比值、载脂蛋白B以及丙二醛水平降低,差异有统计学意义(P<0.05),而且肝脏和主动脉组织中总胆固醇和甘油三酯含量以及主动脉粥样斑块面积比均小于模型组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论花椒挥发油具有抗豚鼠实验性动脉粥样硬化形成的作用;这种作用与它降低血清过氧化脂质水平、抗脂质过氧化损伤有关。

新型抗菌肽分子的计算机辅助设计

目的 通过计算机辅助设计 ,获得具有高活性的新型抗菌肽分子序列 ,为合成这类抗菌肽和通过基因工程方法生产新型药物提供理论依据。方法 通过互联网和计算机软件比较和分析了大量有关抗菌肽的序列和空间结构 ,根据分析结果 ,设计了可能具有很好抗菌活性的抗菌肽分子 ,并用空间结构分析软件观察其可能的结构 ,进行三维结构的计算和预测 ,与已知的抗菌肽分子进行比较。结果 分析发现抗菌肽一般在肽分子的两头分别形成螺旋 ,螺旋趋势强弱与抗菌肽的活性呈一定的正相关。根据这些资料和分析结果 ,设计了一些抗菌肽序列。其中一个序列为 :GWL RKIGKRIKRIGQYFSDAAL EVL GVA。经一级结构分析和空间构象分析显示 ,这一设计的抗菌肽分子可能具有较强的抗菌活性。结论 随着各种数据库和分子生物学软件的完善和丰富 ,充分利用它们进行新分子的设计成为可能。

雷公藤多苷对小鼠腹腔激活巨噬细胞杀伤活性和NO分泌影响的实验研究

雷公藤多苷可以作为免疫抑制剂用于自身免疫性疾病的治疗,如子宫内膜异位症、哮喘、肝炎等,既可以抑制细胞免疫又可以抑制体液免疫。目的:探讨雷公藤多苷(TWP)对小鼠腹腔活化巨噬细胞杀伤活性和NO分泌的影响。方法:分离小鼠腹腔巨噬细胞,用脂多糖(LPS)激活,给予雷公藤多甙(TWP)进行共同孵育;分别以间接MTT法和Griess试剂检测巨噬细胞的杀伤活性和上清NO的含量变化。结果:雷公藤多苷能有效抑制小鼠腹腔激活巨噬细胞的杀伤活性以及NO的生成。

重组人白血病抑制因子受体α亚基细胞外区的分子克隆

目的：纯化可溶性白血病抑制因子（ＬＩＦ）受体，获得特异性免疫原并利用衰变加速因子（ＤＡＦ）的附膜特性探讨ＬＩＦ受体的生物特性和功能。方法：采用基因重组技术，将ＬＩＦ受体α亚基（ｇｐ１９０）细胞外区（ｇｐ１９０ｓｏｌ）的Ｃ端与ＤＡＦＣ端３７个氨基酸连接，再将该重组基因载入ｐＧＥＸ５Ｔ表达系统。结果：在Ｅ．ｃｏｌｉＸＬ１中可高度表达一种Ｎ端为谷胱甘肽Ｓ转移酶和Ｃ端为１９０ｓｏｌＤＡＦ的融合重组蛋白。此蛋白在ＸＬ１中表达产物为不溶性包涵体，以变性剂８ｍｏｌ／Ｌ尿素溶解并复性后，可与交联在亲和层析柱上的谷胱甘肽（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ）结合，从而一次性分离ＬＩＦ受体α亚基细胞外区。结论：大分子糖蛋白也能采用ｐＧＥＸ５Ｔ系统在大肠杆菌中表达，并通过谷胱甘肽亲和法纯化而作为免疫原。

细胞凋亡调节的分子遗传机制

凋亡是程序细胞死亡的一种形态学上的独特形式，在生物体的发育、自身稳定及许多疾病中起重要作用。凋亡通过一种细胞固有的自杀程序的激活来完成。凋亡细胞膜的分子变化对促进吞噬细胞的识别和清除是至关重要的。几乎所有哺乳动物细胞都具有凋亡程序的成分，但凋亡程序的激活受细胞内和细胞外的多种不同信号的调节。通过对秀丽隐杆线虫和黑腹果蝇的遗传研究，已分离出一些调节凋亡的特异基因，ｃｅｄ－３／ＩＣＥ样半胱氨酸蛋白酶及ｒｅａｐｅｒ基因都起很重要的作用，至少凋亡程序的某些成分在整个动物进化中一直被保存下来，广泛存在于蠕虫、昆虫和脊椎动物中。

人原发性肝癌中p16基因表达及CpG岛甲基化状态的研究

目的 进一步探讨人原发性肝癌中 p16基因 m RNA转录水平变化与其基因启动子区 Cp G岛甲基化的关系 ,及其在肝癌发生中的意义。方法 采用狭缝印迹杂交检测 2 0例人原发性肝癌及相应的癌旁、远癌组织及 2例正常人肝组织中 p16基因 m RNA表达水平 ,以甲基化特异性 PCR分析各组织中 p16基因启动子区 Cp G岛的甲基化状况 ,并进行统计分析。结果 2 0例人原发性肝癌中 14例 (70 % ) p16 m RNA水平比远癌组织显著降低 ;13例 (6 5 % )显示 p16基因启动子区 Cp G岛甲基化 ,其中 84 .6 % (11例 )伴 p16 m RNA转录水平降低。结论 人原发性肝癌中存在高频率的 p16基因表达失活 ,其主要机制可能是启动子区 Cp G岛甲基化抑制了基因的转录 ,在人原发性肝癌的发生发展中有重要作用。其临床诊断和治疗意义有待进一步深入研究。

SV40与细胞永生化

目的 探讨 SV40如何介导细胞永生化 ,与细胞永生化现象相关的因素及它们的作用。方法 复习近十年有关细胞永生化与复制衰老现象研究的文章 ,对 SV40介导的细胞永生化及其相关因素进行综述。结果细胞永生化涉及病毒 DNA的整合 ,端粒酶的活化 ,生长抑制因子的失活等多方面的因素 ,它们的作用机制密切相关。结论 细胞永生化的研究有助于更广义地理解细胞生物学现象 ,并可作为标准细胞在细胞工程及组织工程的研究中发挥作用。

人血清对氧磷酶-1活性与血脂及主要载脂蛋白含量的相关性初探

目的 初步分析健康成人血清对氧磷酶 - 1(PON1)活性与血脂及主要载脂蛋白含量的相关性。方法用比色法测定 PON 1活性 ;用酶法测定甘油三酯 (TG)和总胆固醇 (TC)含量 ;用沉淀法分离高密度脂蛋白并用酶法测定高密度脂蛋白胆固醇 (HDL - C)含量 ;用 Friedewald公式计算低密度脂蛋白胆固醇 (L DL - C)含量 ;用免疫单扩散法测定载脂蛋白 (apo) A 、B10 0、C 、C 和 E含量。结果 4 7例健康成人血清 PON1活性与 TG、TC、HDL - C及 L DL - C的相关系数分别为 - 0 .111、0 .177、0 .2 2 8及 0 .0 71(P均 >0 .0 5 ) ;与 apo A 、B10 0、C 、C 及 E的相关系数分别为 0 .2 0 3、- 0 .2 12、- 0 .0 6 5、- 0 .112及 - 0 .12 2 (P均 >0 .0 5 )。结论 正常成人血清

人原发性肝癌中p16,p15基因CpG岛甲基化研究

目的 检测人原发性肝癌中 p16和 p15基因 5’启动子区CpG岛的异常甲基化 ,并分析其与人原发性肝癌发生发展的关系 ,探索其在临床早期基因诊断和治疗中的意义 .方法 用敏感的甲基化特异性PCR检测 2 0例人原发性肝癌患者癌组织、癌旁组织和远癌正常组织中p16 ,p15基因5’CpG岛的甲基化状况 ,统计分析这两个基因 5’CpG岛甲基化与肝癌病理特征的相关性 .结果 2 0例原发性肝癌肝癌组织中 p16和 p15基因 5’CpG岛分别有 6 5 %(13/2 0 )和 5 0 %(10 /2 0 )异常甲基化 ;癌旁组织中 p16和 p15基因 5’CpG岛分别有 6 0 %(12例 )和 4 0 %(8例 )异常甲基化 ;远癌正常组织中p16和 p15基因 5’CpG岛分别有 35 %(7例 )和 2 5 %(5例 )异常甲基化 .p16 ,p15基因 5’CpG岛甲基化在癌组织和癌组织旁、癌组织和远癌组织中均有相关性 .两个基因 5’CpG岛异常甲基化与临床病理特征无显著相关性 .结论 p16和 p15基因 5’CpG岛异常甲基化在人原发性肝癌中频率很高 ,可能在肝癌发生发展中扮演了重要角色 ;而且这可能是一个早期事件 ,其临床早期诊断和基因治疗意义均值得进一步深入研究 .

ptsA58H质粒转染人胚腱细胞的增殖特性及端粒酶活性分析

目的 分析体外长期传代 pts A5 8H质粒转染人胚腱细胞的增殖能力及端粒酶活性。方法 选用连续传代培养的第 40代、第 70代、第 75代转化人胚腱细胞 ,免疫组化染色观察细胞分泌胶原类型 ,比较细胞生长曲线 ,并行染色体核型分析 ,流式细胞术检测细胞增殖周期 ,提取细胞总 RNA,RT- PCR二步法检测细胞人端粒酶逆转录酶 m RNA表达。结果 转化人胚腱细胞传代至 70代以后 ,细胞形态发生改变 ,出现复制衰老现象。细胞仍具有正常分泌 型胶原的能力 ,转化人胚腱细胞染色体呈异倍性 (2 n=94)。转化人胚腱细胞无人端粒酶逆转录酶m RNA特异扩增带 ,无端粒酶活性表达。结论 单纯 SV40转染不能使人胚腱细胞永生化 。

Smad3D和Smad7重组腺病毒载体的快速构建

目的 简化重组腺病毒载体的构造方法 ,构建含Smad3DcDNA或Smad7cDNA的重组腺病毒载体 ,为下一步的基因治疗奠定基础。方法 以AdEasySystem为基础 ,应用序贯化学转化方法 ,在大肠杆菌E .coliBJ5 183体内将携带目的基因的穿梭质粒和骨架质粒重组。结果 成功构建了重组腺病毒载体pAd Smad3D和 pAd Smad7及空腺病毒载体 ,并经酶切鉴定证实。结论 用序贯化学转化方法 ,可以快速高效地在大肠杆菌内构建重组腺病毒载体。

花椒挥发油在体外对低密度脂蛋白氧化的影响

目的探讨花椒挥发油能否对抗脂蛋白的氧化。方法采用CU2+介导正常人低密度脂蛋白(LDL)的氧化反应,应用硫代巴比妥酸法测定LDL氧化过程中硫代巴比妥酸反应物质(TBARS)的变化,采用琼脂糖凝胶电泳测定氧化型低密度脂蛋白的相对电泳迁移率(REM)的变化。结果40MG/ML的花椒挥发油对CU2+介导LDL氧化修饰时TBARS与REM的差异有统计学意义(P<0.01)。未加花椒挥发油的对照组LDL氧化反应延滞期为1H,在2~4H后TBARS值进入快速增长期,于24H达到高峰并趋于稳定;而在花椒挥发油组(40MG/ML组),LDL的氧化反应延滞期延长到4H左右,快速增长期延长到6~8H;但TBARS最大值无明显降低。结论花椒挥发油能够在体外对抗CU2+介导LDL的氧化修饰。

嗜麦芽黄单胞菌基因组DNA快速提取方法

目的 建立一种快速简便提取嗜麦芽黄单胞菌 (X anthomonas maltophilia)基因组 DNA的方法。方法 用去污剂 SDS和 CTAB破坏细胞膜结构 ,使胞内核酸释放 ,用酚 /氯仿 /异戊醇去除蛋白质 ,异丙醇沉淀DNA,TE溶解 DNA。结果 提取的 DNA琼脂糖电泳图谱与 Hauben及 Dufresne方法提取的 DNA图谱相同 ,DNA含量为 34 2～ 388μg/ m l,OD2 60 / OD2 80 为 1.88～ 1.90。 DNA能被 Eco R 酶切消化。结论 本方法能快速简便提取 X.maltophilia DNA,提取的 DNA含量较高、纯度较好 ,可用于酶切分析、构建文库及 PCR操作。

雷公藤甲素对小鼠巨噬细胞活性和NO分泌的影响

目的：探讨雷公藤甲素（TP）对子宫内膜异位症患者腹腔液中大量激活的巨噬细胞免疫抑制作用机制，以及其在不同剂量TP和不同时间段的杀伤活性和对NO分泌的影响。方法：体外培养由脂多糖（LPS）诱导激活的小鼠腹腔巨噬细胞，采用噻唑盐比色（MTT）间接法观察其杀伤活性的变化，并用硝酸还原酶法检测其上清波NO的含量变化。结果：1～10μg／ml TP对巨噬细胞杀伤活性和NO的产生具有明显抑制作用（P〈0．01），且无细胞毒性。TP〈1μg／ml无统计学意义（P〉0．05）。结论：TP能有效抑制小鼠腹腔液中活化巨噬细胞和NO的生成，为临床治疗子宫内膜并位症提供实验依据。

诱导免疫应答的一种新手段──基因免疫

近年来，一种诱导免疫应答的新手段─—基因免疫，正在引起人们越来越多的关注．所谓基因免疫，是将含有编码序列及必要表达调控元件的质粒ＤＮＡ，直接导入动物组织，经诱导动物免疫系统对编码序列所表达的蛋白质发生免疫应答，达到免疫的目的．文章介绍了基因免疫的基本方法，综述了这一新兴领域中涉及传染病、肿瘤、移植等方面的研究成果及存在的问题。

从DNA修复机理看细胞癌变的发生机制

ＤＮＡ损伤是引起基因突变，导致细胞恶性转化的重要原因．ＤＮＡ损伤的修复过程非常复杂，是与细胞周期调节、ＤＮＡ复制和ＤＮＡ转录等生命活动紧密相连的．首先ＤＮＡ修复需要细胞周期停滞，避免ＤＮＡ损伤进入子代细胞．其次，参与ＤＮＡ转录的某些基因产物参与ＤＮＡ损伤的识别，有利于转录链的优先修复．最后，ＤＮＡ修复系统ＮＥＲ、ＭＭＲ参与损伤修复．上述ＤＮＡ修复过程任何环节的异常，都将造成ＤＮＡ修复功能减弱，导致某些功能基因突变，从而导致细胞的恶性转化．

615小鼠H-2K^k基因cDNA的克隆及序列测定和分析

目的 :克隆 6 15小鼠主要组织相容性复合体 (MHC)Ⅰ分子抗原识别基因H_2Kk 并测序分析 ,为转基因治疗提供目的基因。方法 :采用RT_PCR法从 6 15小鼠肝组织总RNA中获得 1 4kb的H_2Kk 基因cDNA ,将其定向连接至PGEM3Zf(+)载体 ,转化E coliJM10 9,限制性内切酶筛选出阳性克隆PGEM3Zf(+)_H_2KkcDNA ,末端终止法完成H_2KkcDNA的全序列测定。结果 :测得的H_2KkcDNA序列与文献报道序列同源性高达 99% ,编码MHCⅠ分子抗原识别部位的氨基酸残基的核苷酸序列完全相同。结论 :成功克隆了 6 15小鼠MHCⅠ分子抗原识别基因 。