实验准备及技术人员在提高医学微生物学教学质量中的作用

实验课是现代医学微生物学课程中不可或缺的部分。然而,在考虑医学微生物学实验教学改革时,我们往往忽略了实验课教学准备工作及实验技术人员在高质量完成教学任务中的重要性。本文结合复旦大学2000年前、2000—2010年及现阶段医学微生物学实验教学改革情况,分析并讨论实验课教学准备工作必须考虑的问题及所需实验条件,提出实验技术人员素质及实验课教学准备在保证医学微生物学实验教学质量中的重要性,为医学微生物学实验教学改革提供借鉴。

肠道病毒71型感染诱导细胞程序性死亡形态学及分子生物学特征的初步研究

肠道病毒71型(enterovirus type 71,EV71)感染常可引起婴幼儿手足口病(hand,foot and mouth disease,HFMD),还可引起中枢神经系统并发症等重症,甚至死亡。研究认为,EV71诱发重症的原因主要与病毒感染诱导细胞程序性死亡(programmed cell death,PCD)及诱导细胞产生大量炎症因子有关。病毒感染可通过激活不同的信号通路触发细胞程序性死亡,主要包括含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase,caspase)依赖的细胞凋亡、细胞焦亡,以及非caspase依赖的细胞坏死性凋亡。本研究旨在探讨EV71感染诱导细胞程序性死亡的形态学和分子生物学特征,利用显微镜和免疫荧光技术检测EV71感染后细胞形态变化,JC-1染色检测感染后细胞线粒体膜电位变化,流式细胞术及Annexin VFITC/PI双染法、乳酸脱氢酶释放量法检测感染细胞的细胞膜损伤程度,结合蛋白免疫印迹法检测病毒感染后细胞中多聚ADP核糖聚合酶[poly(ADP-ribose)polymerase,PARP]、caspase-9、caspase-3等凋亡因子,以及细胞焦亡关键效应蛋白Gasdermin D、坏死性凋亡效应蛋白MLKL的磷酸化情况。结果显示,EV71感染后细胞主要呈现凋亡特征,并伴随少量细胞坏死。与细胞凋亡相关的PARP被剪切,caspase-9和caspase-3等相关因子被激活。经泛caspase抑制剂处理后,细胞程序性死亡被抑制,但仍有部分细胞坏死。结果提示,EV71感染以细胞凋亡为主,也可能存在非caspase依赖的细胞程序性死亡。

氧化苦参碱在鸭原代肝细胞中抗鸭乙肝病毒(DHBV)作用的研究

通过建立鸭原代肝细胞-DHBV感染模型研究氧化苦参碱抗DHBV的作用。分别在DHBV感染前、感染同时以及感染后给药，利用打点杂交、Southern印迹核酸杂交和荧光定量PCR方法分别检测培养细胞上清及细胞内病毒核酸，观察氧化苦参碱在病毒感染的各个环节所起的抗病毒作用。实验结果显示：1mg／mL氧化苦参碱处理细胞后，鸭原代肝细胞培养上清及细胞内的DHBV核酸明显低于病毒感染对照组，病毒抑制率达91．6％；在病毒感染同时加药对病毒的抑制率可达98．5％；感染后持续用药能使不同培养天数的鸭肝细胞内的DHBV核酸降低60．5％～96．6％；氧化苦参碱与DHBV共孵育后，可以使病毒感染力下降69．6％。结果说明氧化苦参碱可以在DHBV感染鸭原代肝细胞的多个环节，包括病毒吸附、进入细胞及细胞内复制等方面发挥抗病毒作用。

卡介菌多糖核酸免疫治疗结核病小鼠的实验研究

目的观察卡介菌多糖核酸(BCGPSN)对结核分枝杆菌感染小鼠的免疫保护作用及其免疫学机制。方法将BALB/c小鼠48只随机分成BCGPSN免疫治疗组和结核菌感染对照组,每组24只。两组小鼠制成结核分枝杆菌感染模型。感染后1周,每天分别腹腔内注射BCGPSN(10mg/kg)或生理盐水(10mL/kg),连续7d。感染后3周和4周每组处死12只小鼠,检测小鼠体重以及肺、脾脏湿重,观察肺脏病理改变,取肺、脾组织进行结核菌培养和菌落计数,用real-timePCR法测定肺、脾组织IFNγmRNA、IL10mRNA和IL4mRNA的表达。结果感染后4周,治疗组小鼠体重和脾脏重量高于对照组,肺脏重量低于对照组,且肺部病变较轻。感染后3周和4周,治疗组小鼠肺、脾组织结核菌落均低于对照组,小鼠肺组织IFNγmRNA表达与对照组无差别,IL10mRNA和IL4mRNA的表达低于对照组。感染后3周,治疗组小鼠脾组织IFNγmRNA表达与对照组相似;感染后4周,脾组织治疗组脾组织IFNγmRNA的表达高于对照组。感染后3周和4周,IL10mRNA和IL4mRNA的表达低于对照组。结论BCGPSN可减轻结核病小鼠体重下降,减少结核病小鼠肺和脾脏结核菌数量,并增强Th1型免疫反应。

外泌体与病毒感染及HBV相关肝病的关系

HBV感染后可导致肝脏组织炎症和肝细胞坏死,甚至发生肝纤维化等病理变化,驱动着"慢性肝炎-肝硬化-肝癌"的进展,但其机制尚不完全明了。被HBV感染的肝细胞与其他未感染细胞及宿主免疫系统之间发生相互作用的可能机制即通过肝脏微环境中由外泌体介导的细胞与细胞间的相互沟通。多项研究表明病毒感染可以调节外泌体的生成并影响其组成,病毒microRNA、蛋白质甚至整个病毒都可能被包裹进入外泌体,从而影响病毒的免疫识别或调节邻近细胞的功能。阐述了外泌体的产生和组成,及其在病毒感染过程中的作用,并进一步对外泌体与HBV感染等方面的研究进展进行了讨论。

新型H7N9禽流感病毒汹汹来袭

突发传染性疾病始终是威胁人类健康的一大隐患。1997年香港暴发H5N1禽流感、2003年暴发严重急性呼吸综合征（severeacuterespiratorysyn—drome，SARS）、2009年墨西哥流行H1N1流感，2012年出现新型冠状病毒感染，屡屡暴发的疫情让人们的神经一次又一次地紧张起来。这一次我们面临的威胁是H7N9禽流感。

作用于HIV-1gp120小分子HIV进入抑制剂NC-2的虚拟筛选及其作用机制

目的基于中和抗体VRC01与HIV-1 gp120的结合模式,利用计算机虚拟筛选,从IBS天然产物数据库中筛选靶向HIV-1gp120的小分子HIV-1进入抑制剂,并对其抗病毒活性和机制进行研究。方法运用MM-PBSA方法计算候选化合物与HIV-1gp120结合后自由能的变化;利用HIV-1假病毒、活病毒技术及细胞融合实验,检测化合物抑制HIV-1感染的活性;XTT比色法检测化合物对细胞的毒性;采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)研究化合物体外抗病毒活性的机理。结果利用计算机从40 000个化合物中虚拟筛选出19个与gp120结合后自由能降低较大的小分子化合物,其中NC-2具有抑制HIV-1感染和细胞融合的活性,其抑制HIV-1实验株IIIB的IC50是1.95±0.44μmol/L,抑制HIV-1JRFL假病毒的IC50是10.58±0.13μmol/L。酶联免疫吸附法结果表明NC-2体外能抑制HIV-1 gp120与CD4的结合,但不抑制HIV-1 gp41六螺旋的形成。结论该计算机虚拟筛选的方法可为开发作用于HIV-1 gp120的小分子进入抑制剂提供参考。同时,通过计算机辅助设计加病毒活性筛选的方法,得到一个新颖结构的HIV进入抑制剂NC-2。

DNA的识别分子及其识别模式

固有免疫以TLR9依赖和TLR9非依赖的方式对DNA识别,在保护性免疫和病理性自身免疫反应中发挥重要作用.目前发现TLR9,DAI(DLM-1/ZBP1),RIG-I,尚未定义的识别B-DNA的分子,损伤DNA结合分子如:DNA-PKcs,Ku70,p53,ATM,ATR和含有SAP或PHD结构域等的分子可以识别DNA,并且分别以不同的识别模式识别细胞不同部位或不同类型的DNA.近几年来国内外针对DNA识别的研究较多并取得了重要进展,给研究保护性免疫和自身免疫提供了新的视野.文中结合作者所在实验室的研究探索,对DNA的识别分子和识别模式的研究进展进行综述.

寨卡病毒引发小头症?关系越确定,防治越迫切!

自2015年初至今,寨卡病毒(Zika virus,ZIKV)以巴西为首先后在数十个国家和地区暴发流行。几乎同时,与日俱增的小头症患儿使全球对此陷入警惕状态。目前,全球正在积极探索ZIKV感染所引发的各种神经系统疾病。在越来越多证据表明在细胞水平和动物模型中ZIKV能直接损伤胚胎脑部发育的同时,ZIKV感染者的防治需求也越来越迫切。本文从ZIKV的流行病学、与小头畸形因果关系的研究进展及其预防疫苗和治疗药物的研究现状等方面进行概述。

利用I-Mutant2.0辅助设计与优化中东呼吸综合征冠状病毒融合抑制多肽

Ⅰ型膜融合蛋白(class I membrane fusion protein)在Ⅰ型包膜病毒入侵宿主细胞过程中发挥重要作用。基于抑制六螺旋结构形成的多肽类融合抑制剂设计的原理是模拟该蛋白融合区域的自身序列,与病毒融合蛋白结合形成异源六聚体,从而阻断病毒与靶细胞膜的融合。此类融合抑制剂的传统设计主要基于一级与二级结构,但为进一步强化其抗病毒活性,通常需依赖病毒膜融合蛋白三级结构信息,从而限制了对那些尚无病毒蛋白三级结构信息的新发病毒的多肽类融合抑制剂的快速优化和研发。本研究提出了不依赖蛋白三级结构信息,而利用I-Mutant2.0软件来辅助设计和优化多肽类病毒膜融合抑制剂的设想。根据I-Mutant2.0的预测结果,以中东呼吸综合征冠状病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus,MERS-CoV)为模型,分析该病毒HR2区融合抑制剂序列中若干适合与不适合优化的位点,并设计了一系列多肽。结果发现,对适合优化的位点进行调整的多肽,其对HR1的结合能力及对病毒的抑制活性均有所提升;反之,多肽活性明显下降。结果表明,利用I-Mutant2.0辅助设计与优化病毒融合抑制多肽的方法具有一定的可行性,为进一步开发新的融合抑制剂设计方法奠定了基础。

丙型肝炎病毒感染过程中其NS3/4A蛋白酶切割线粒体抗病毒信号蛋白的动态过程

已知丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)可通过其蛋白酶NS3/4A切割线粒体抗病毒信号蛋白(mitochondrial antiviral signaling protein,MAVS)来逃逸天然免疫识别,但尚不清楚其切割动力学及切割在抑制干扰素中的作用。本研究旨在细胞模型中探讨HCV感染过程中病毒复制建立及病毒NS3/4A切割MAVS的动态过程,探究NS3/4A切割MAVS对病毒逃逸宿主天然免疫建立感染的贡献。首先构建基于绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的MAVS切割报告系统(GFP-NLS-MAVS-TM462),用HCV Jc1-Gluc感染Huh7.5/GFP-NLS-MAVS-TM462细胞。结果显示,病毒复制早期MAVS切割效率较低;NS3/4A高效切割MAVS发生于HCV复制晚期,且其切割效率与NS3蛋白水平相关。利用带有GFP ypet的HCV报告病毒Jc1-378-1感染Huh7.5/RFP-NLS-MAVS-TM462细胞,在单细胞水平观察HCV感染阳性细胞中MAVS被切割情况,发现HCV复制细胞中仅部分细胞MAVS被切割。进一步研究发现,不同基因型NS3/4A切割MAVS的效率仅与NS3表达水平相关。以上结果提示,HCV蛋白酶NS3/4A切割MAVS依赖NS3/4A蛋白在病毒复制过程中的累积,对在病毒复制早期逃逸宿主天然免疫建立感染可能无显著贡献。

结核分枝杆菌(MTB)异质性耐药研究进展

异质性耐药,是指在同一样本中同时存在耐药菌和敏感菌的现象,这体现了细菌群体从部分耐药向完全耐药转变的过程。研究异质性耐药对于认识耐药结核病的发展过程,以及评估治疗方案和指导临床用药具有重要的意义。本文对结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)异质性耐药的产生及其对临床的影响进行了综述。

紫草多糖抑制LPS活化PBMC表达炎症相关因子的基因转录

目的：研究紫草多糖对LPS活化外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cells,PBMC）表达TNF-α、IL-10、IL-18相关因子的影响及其可能的信号通路。方法：LymphopreTM（1.077 g/ml）淋巴细胞分离液离心分离正常健康人PBMC,紫草多糖处理正常健康人的PBMC或LPS活化的PBMC,利用Real-time RT-PCR法检测TNF-α、IL-10、IL-18、IL-18BP、IL-18Rα、IL-18Rβ基因转录水平,通过Western blot检测PBMC中ERK磷酸化水平。结果：紫草多糖可增强PBMC TNF-α、IL-10、IL-18Rα、IL-18Rβ的转录,与LPS处理的PBMC相近。紫草多糖处理LPS活化的PBMC,在处理早期（4小时）可抑制LPS活化的PBMCTNF-α及IL-18的表达,抑制率达15%50%（P〈0.05）;并可抑制LPS诱导的ERK磷酸化,抑制率达27%61%（P〈0.05）。结论：紫草多糖可能是通过抑制PBMC的MAPK信号通路进而抑制LPS诱导的炎症相关因子TNF-α等高表达。

哺乳动物细胞表面展示全长类风湿关节炎抗体库的构建

目的采用哺乳动物细胞表面展示技术构建全长人源类风湿关节炎抗体库。方法分离类风湿关节炎患者的外周血淋巴细胞,提取总RNA,采用RT-PCR的方法扩增抗体全长轻链基因和重链可变区基因,分别插入哺乳动物细胞表达载体pDGB-HC-TM,电击转化感受态大肠杆菌TOPO-10,分别构建抗体轻链基因库和抗体重链基因库,然后将抗体轻链、重链基因库联合转染293T细胞,用流式细胞仪分析全长人源抗体在293T细胞表面的表达。结果成功构建了类风湿关节炎患者来源的IgG1-Kappa型抗体基因库,随机挑选单克隆经DNA序列分析显示轻链库、重链库的序列正确率分别为80%和60%,可表达的抗体库多样性为6.13×1010。结论类风湿关节炎抗体基因库转染293T细胞后能够在细胞表面表达全长人源抗体,所展示的抗体库具有良好的多样性,能够为下一步筛选特异性抗体奠定基础。

干扰素治疗慢性乙肝患者外周血调节性T细胞动态变化和临床意义

目的探讨干扰素抗病毒治疗过程中慢性乙肝患者外周血CD4+CD25+调节性T细胞(CD4+CD25+Treg)的变化及其临床意义。方法采集干扰素抗病毒治疗的CHB患者46例外周血,在治疗前及治疗后12、24、36、48周,停药后24周时,分别以流式细胞仪检测外周血CD4+CD25+Treg比例,实时荧光定量RT-PCR检测血清HBV-DNA载量,酶联免疫吸附法检测HBV标志物,全自动生化分析仪检测ALT水平。结果在46例CHB患者中,完全应答的13例患者CD4+CD25+Treg频率在12、24、36、48周及停药后24周时分别为(4.16±0.64)%、(3.98±0.75)%、(3.70±0.55)%、(3.44±0.48)%、(3.07±0.48)%,呈逐步下降趋势,明显低于治疗前(5.73±0.62)%(P<0.01)。部分应答的18例患者CD4+CD25+Treg频率在12、24、36、48周及停药后24周时分别为(4.98±0.62)%(、4.50±0.54)%、(4.10±0.64)%、(4.02±0.64)%(、3.82±0.47)%,呈逐步下降趋势,明显低于治疗前(5.84±0.68)%(P<0.01)。无应答的15例患者CD4+CD25+Treg频率较治疗前无明显变化。完全应答、部分应答组患者Treg频率在12、24、36、48周及停药后24周时与无应答组比较,差异有统计学意义(P<0.01)。治疗24、48周,停药后24周时,HBeAg阴转率分别为10.8%、26.1%、28.3%,发生HBeAg血清学转换者在治疗12周时CD4+CD25+Treg比例明显下降。结论本实验初步认为,干扰素抗病毒治疗过程中及治疗后,有应答的CHB患者的外周血CD4+CD25+Treg频率下降。治疗早期CD4+CD25+Treg比例下降的患者HBeAg血清学转换率可能更高。

医学微生物学实验教学中的生物安全问题探讨

医学院校医学微生物学实验室是培养医学生生物安全意识和无菌观念的重要场所,其开展的实验内容多与人类感染性疾病关系密切。在保证生物安全的条件下培养高素质医学人才是高校管理者探究的热点问题。结合本校医学微生物学实验室存在的生物安全问题,对实验室的安全管理展开探讨,为预防实验室生物安全事故提供参考。

雌二醇与重症手足口病患者细胞因子的相关性研究

本研究旨在分析重症手足口病患者体内雌二醇与细胞因子的相关性,为手足口病诊断和救治提供重要依据。收集临床诊断手足口病患儿的标本,用荧光定量反转录-聚合酶链反应(reverse transcriptionpolymerase chain reaction,RT-PCR)进行肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)和其他肠道病毒的检测,同时采用化学发光免疫和Milliplex多因子检测技术分析血清中的雌二醇和细胞因子。结果显示,手足口病重症组、轻症组、健康对照组的雌二醇水平分别为(6.12±6.08)pg/mL、(30.2±10.16)pg/mL、(20.62±7.43)pg/mL,差异有统计学意义;重症组与轻症组之间γ干扰素(interferonγ,IFN-γ)、白细胞介素8(interleukin8,IL-8)和IL-6水平差异有统计学意义,血清中IL-8和IL-6水平与雌二醇水平呈负相关。结果证实,手足口病患儿血清中雌二醇水平与IFN-γ、IL-8和IL-6水平密切相关,可作为重症手足口病临床判断的生物标记,有助于临床判断疾病严重程度,提早干预治疗,为防治重症并发症提供依据。

哺乳动物细胞表面展示人源HIV特异性全长抗体库的构建

目的构建人源的HIV特异性全长抗体基因库并获得可稳定展示全长抗体的哺乳动物细胞库。方法提取HIV患者外周血淋巴细胞的总RNA,采用RT-PCR的方法扩增抗体重链可变区(VH)基因,插入哺乳动物细胞表达载体pDGB4,转化感受态大肠杆菌TOPO-10,构建抗体基因库,随后将抗体库的质粒DNA稳定转染FCHO细胞,获得可稳定展示全长抗体的细胞库,用流式细胞仪分析全长抗体在FCHO细胞表面的表达。结果本研究以少量外周血淋巴细胞RNA为来源,构建了库容量为7.77×104的全长抗体基因库;将基因库的质粒DNA稳定转染FCHO细胞后,获得了可稳定展示全长抗体的细胞库;经流式细胞仪分析,有67%的细胞表面可表达可被检测到的全长抗体。结论本研究构建了人源的HIV特异性全长抗体基因库并获得可稳定展示全长抗体的哺乳动物细胞库,为治疗HIV感染的特异性抗体的筛选打下了基础。

导读与评议(2017年第4期)

由于历史原因和结核病的特殊性,中国是世界上紧随印度之后的22个结核病高负担国家之一。结核分枝杆菌感染严重危害人类健康,影响经济发展。2015年世界卫生组织提出终止结核病流行的目标：2030年结核病死亡率降低90%,发病率降低80%;