幽门螺杆菌的生物学特性及其免疫学研究

研究一株幽门螺杆菌 HP-WGM的生物学特性及它和三种脲酶亚单位蛋白的免疫原性 ,为研制疫苗提供必要、有价值的材料。在厌氧微生物技术培养后 ,通过各项生理生化实验确定菌株的生物学特性。采用 PCR等分子生物学技术获得脲酶亚单位蛋白 ,EL ISA试验分析它们的免疫原性。 HP-WGM革兰染色阴性 ,杆状 ,稍弯曲 ,带鞭毛。该菌脲酶 ,触酶 ,氧化酶均为阳性 ,不还原硝酸盐 ,H2 S的生成试验阴性 ,其生长耐受 3 .5% Na Cl、1 %甘氨酸 ,水解淀粉 ,不液化明胶。该菌和 3种表达得到的幽门螺杆菌脲酶亚单位蛋白 Ure Ac、Bc、A均具有一定的免疫原性。该菌可作为一种抗原 ,检测幽门螺杆菌感染的程度。 3种脲酶亚单位蛋白不仅可用于检测感染程度 ,还可能是一种非常有效的药物。

huGM-CSF(9-127)-IL-6(29-184)融合蛋白的复性及纯化研究

利用QSepharoseH .P .离子交换柱层析在 8mol L尿素变性条件下对huGM CSF(9 12 7) IL 6 (2 9 184)融合蛋白进行初步纯化 ,然后再利用SephacrylS 2 0 0分子筛柱层析复性及纯化后获得目的蛋白 ,其纯度达到 95 %以上。该纯化方案成功地解决了稀释复性或透析复性产物在进行QSepharoseH .P .离子交换柱层析时目的蛋白不稳定而沉积于柱上的问题 ,获得了较好的复性效果 ,复性率达到 80 %以上。使用该纯化方案 ,1天内便可基本完成重组蛋白的复性及纯化过程 。

巴斯德毕赤酵母研究进展

巴斯德毕赤酵母以其独特的生物学和遗传学特征成为当今一种诱人的外源基因表达系统,已成功地表达了各种类型的外源蛋白。本文综述了巴斯德毕赤酵母的一些特征及其作为外源基因表达系统,实现高表达的策略。

SV40灭活疫苗的制备及其对小鼠免疫的研究

猿猴空泡病毒40(Simian vacuolating virus 40,SV40) 属于乳多空病毒科,是一种DNA肿瘤病毒。亚洲猿类特别是恒河猴是SV40的天然宿主。感染SV40病毒可导致猴体急性病变或呈长期带毒状态,此外能诱使幼鼠产生肿瘤,并能使多种培养细胞发生转化。本研究初步建立了SV40 病毒在Vero细胞中的增殖培养方法,并且初步建立了β丙内脂灭活病毒的方法和纯化工艺。使用SV40病毒灭活疫苗对Balb/c小鼠进行了免疫,结果表明该疫苗具有较好的免疫原性。随后对SV40 病毒DNA在免疫小鼠的重要脏器中的整合情况进行了调查,结果表明SV40病毒DNA未在小鼠重要脏器中整合。本研究为SV40病毒灭活疫苗的研制和进一步开展猴体抗SV40 感染实验奠定了良好的基础。

幽门螺杆菌的分离与特性研究

目的 分离一株幽门螺杆菌 ,研究它的生物学特性及免疫原性 ,同时比较几种检测手段的优势。方法 采用厌氧微生物培养技术及PCR检测方法分离、初步鉴定幽门螺杆菌。重点对其中一株菌HP -WGM做各项生理生化实验 ,ELISA试验分析。结果 从 10 6位患者中分离鉴定得到 4 0株疑似幽门螺杆菌。HP -WGM菌株革兰氏染色阴性、杆状、稍弯曲、菌体的一端着生数根带鞘鞭毛。该菌脲酶、触酶、氧化酶均为阳性 ,不还原硝酸盐 ,H2 S的生成试验阴性 ,其生长耐受 3 5 %NaCl、l%甘氨酸 ,水解淀粉 ,不液化明胶。该菌有一定的免疫原性。结论 HP -WGM菌株可作为一种抗原用于检测幽门螺杆菌的感染程度。对于疾病的确诊 ,应采用至少 2种以上的检测手段 ;用于科学研究时 ,细菌培养、鉴定的方法才是最为可靠的手段。

肠道病毒71型的生物学特征及研究进展

近年来，肠道病毒71型（enterovirus71，EV71）的流行在亚太地区呈逐渐上升趋势。EV71导致的手足口病已引起社会各界广泛关注，并成为医学预防和基础科研的挑战。此文就EV71的生物学特性、流行病学、致病机制、临床和实验室诊断、预防及治疗等方面的研究进展作一综述。

靶向survivin利用RNA干扰技术影响云南个旧肺鳞癌细胞株YTMLC凋亡的初步研究

目的检测云南个旧肺鳞癌细胞株YTMLC细胞内源凋亡抑制因子survivin基因的表达以及促进YTMLC细胞凋亡的情况。方法构建和转染重组质粒pshRNA-survivin-1和pshRNA-survivin-2至YTMLC细胞株,通过免疫荧光和半定量RT-PCR检测survivin蛋白表达及mRNA转录水平的变化,并通过流式细胞仪使用PI-AnnexinV双染法检测YTMLC细胞株的凋亡。结果构建的2种重组质粒pshRNA-survivin-1和pshRNA-survivin-2均能明显抑制survivin基因的表达;应用免疫荧光检测survivin基因的表达,转染重组质粒pshRNA-survivin-1和pshRNA-survivin-2的实验组survivin荧光强度明显低于转染空载体pGE-1和pshRNA-negative非特异对照质粒;通过半定量RT-PCR检测到sur-vivin基因mRNA转录明显减少,抑制率为80.60%和70.09%;通过PI-AnnexinV双染法检测YTMLC细胞的凋亡分别达(33.42±2.42)%(P<0.01)和(20.09±1.32)%(P<0.01)。结论重组质粒pshR-NA-survivin-1和pshRNA-survivin-2均可明显抑制YTMLC细胞内源survivin的表达和mRNA的转录均可并明显促进YTMLC细胞的凋亡,为survivin介导的肿瘤基因沉寂疗法提供良好的实验基础。

HBsAg/GM-CSF融合蛋白在毕赤酵母中的表达及其免疫原性研究

为探索一种提高乙肝病毒表面抗原免疫原性的新方法,用PCR和基因重组技术构建HBsAg与GM-CSF的融合基因,并在毕赤酵母中分泌表达HBsAg/GM-CSF(S-GM)融合蛋白。表达产物用SDS-PAGE检测,W estern b lot分析,离子交换柱纯化后免疫昆明鼠,ELISA检测免疫小鼠血清中抗HBsAg的抗体水平。结果显示S-GM融合蛋白在毕赤酵母中获得了表达,离子交换柱一步纯化即可得到纯度达90%以上的S-GM。W estern b lot分析S-GM可分别与抗HBsAg及抗GM-CSF的抗体特异结合。ELISA检测发现第一次免疫后4w出现抗HBsAg的抗体,加强免疫后融合蛋白组几乎全部阳转,且抗体水平较HBsAg组(P=0.009<0.05)及HBsAg和GM-CSF的混合物组(P=0.032<0.05)高。HBsAg/GM-CSF融合蛋白能够在毕赤酵母中表达,且可增强HBsAg的免疫原性,为提高乙肝疫苗的免疫效果提供了新的思路与方法。

抗菌肽Cecropin D在毕赤酵母中的表达、纯化及活性鉴定

目的在毕赤酵母GS115中表达抗菌肽Cecropin D,并检测其抗菌活性。方法根据毕赤酵母密码子的偏爱性,人工合成6条寡聚核苷酸片段,经磷酸化、退火、连接并克隆入酵母表达载体pPIC9K。重组表达质粒pPIC9K-D转化至毕赤酵母菌GS115,经G418筛选,阳性高拷贝克隆用0.5%的甲醇诱导表达,表达产物经CM-Sepharose层析柱纯化,Tricine-SDS-PAGE分析,琼脂糖扩散法和比浊法测定其抗菌活性。结果经Tricine-SDS-PAGE检测,在相对分子质量3900左右处可见目的蛋白表达条带,纯化后的目的蛋白纯度达90%以上,获得的抗菌肽Cecropin D对一些革兰阳性菌和革兰阴性菌均有抑菌活性。结论抗菌肽Cecropin D成功地在毕赤酵母中分泌表达,为以后深入研究抗菌肽奠定了基础。

戊型肝炎病毒在人胚肺二倍体细胞KMB17等传代细胞中的繁殖

目的探索戊型肝炎病毒(HEV)敏感细胞及体外培养条件,为HEV体外研究提供基础。方法用戊肝患者急性期阳性粪便悬液感染恒河猴进行毒种的扩增与活化,超速离心处理猴阳性粪便标本获取培养用毒种,将其接种于各种人源性细胞(包括人胚肺二倍体细胞KMB17、人肺癌细胞A549、人肝癌细胞BEL7402、人宫颈癌细胞Hela)和非人灵长类细胞(非洲绿猴肾细胞Vero),通过细胞病变观察、RT-PCR检测及免疫荧光实验来判定细胞是否对HEV敏感。结果KMB17、A549、BEL7402细胞中第一代传代7～9d出现细胞病变,11～13d脱落,传至10代仍可经正链和负链RT-PCR检测到HEV基因组正链RNA和复制的负链RNA的存在,而Hela、Vero细胞未见细胞病变,分别于2～4代后经RT-PCR不能扩增到特异片段。在KMB17细胞培养体系中经免疫荧光实验表明实验组有明显荧光着色,病毒捕获RT-PCR扩增到特异片段。结论在采用的培养条件下,KMB17、A549、BEL7402细胞对HEV敏感,而Hela、Vero细胞不敏感,本研究建立了一定代次内HEV组织培养体系。

huIL-6-GM-CSF(9-127)融合蛋白的表达及活性测定

目的 构建及表达具有huIL 6和huGM CSF双重生物学活性的huIL 6 GM CSF(9- 12 7)融合蛋白分子。方法 应用PCR技术对huIL 6和huGM CSF的基因分别加以改造 ,同时在二者之间加上连接肽序列 (G G S G S) 3 ,克隆PCR产物 ,并构建成pBV2 2 0 IL 6 GM CSF(9- 12 7)表达质粒 ,将表达质粒导入E .coliDH5α中 ,诱导表达融合蛋白。通过QSepharoseH .P .离子交换柱和SephacrylS 2 0 0分子筛柱二步柱纯化以获取目的蛋白。使用MTT法测量其huIL 6和huGM CSF生物学活性。结果 pUC18 IL 6 GM CSF(9- 12 7)的序列与理论设计完全一致 ,表达质粒在E .coliDH5α中得到高效表达 ,表达的融合蛋白占总蛋白含量的 30 %以上 ,表达产物以包涵体的形式存在。通过QSepharoseH .P .离子交换柱和SephacrylS 2 0 0分子筛柱二步柱纯化及复性后获得目的蛋白 ,其纯度达到 96 %以上。融合蛋白具有huIL 6和huGM CSF的双重生物学活性 ,其促进huIL 6依赖细胞株B9和huGM CSF依赖细胞株TF 1增殖的比活性分别为 2 .86× 10 7U/mg和 3.33× 10 8U/mg。结论 获得了具有较高纯度和双重生物学活性的huIL 6 GM CSF(9- 12 7)

轮状病毒P[2]G3株在Vero细胞上的传代适应性

目的研究轮状病毒P[2]G3株在Vero细胞上的传代适应性,以确定其在Vero细胞上培养的最适条件。方法将P[2]G3株轮状病毒分别以0.01、0.05和0.1MOI接种于Vero细胞,观察细胞病变(CPE)情况,并检测病毒的感染性滴度,确定在Vero细胞上接种病毒的最适MOI。同时观察连续传15代后,各代次病毒的滴度及其基因核酸带型的变化。结果MOI为0.05时,接种病毒后出现CPE及收获时间均较早,病毒的感染性滴度最高,确定接种病毒的最适MOI为0.05。连续传15代,病毒滴度随传代次数的增加而上升,各代次病毒的基因组核酸带型基本一致,且与原代病毒相符。结论轮状病毒P[2]G3株经适应性培养后,可在Vero细胞上稳定传代15代。

戊型肝炎病毒ORF3基因在杆状病毒系统中的表达与免疫学性质

目的 利用杆状病毒系统表达戊型肝炎病毒(HEV)ORF3，为进一步研究免疫学性质与功能提供基础。方法 通过RT-PCR方法获得HEV ORF3基因的目的基因片段，插入中间转染载体质粒pVL1393，构建重组质粒，再与杆状病毒线性DNA(BaculoGoldTM)共转染Sf9昆虫细胞，通过同源重组得到重组杆状病毒。以此重组杆状病毒感染昆虫细胞后，对表达的重组蛋白进行免疫学检测并免疫小鼠。结果 表达的重组蛋白约占昆虫细胞总蛋白的2%，可被戊型肝炎患者与实验猴阳性抗血清有效识别，并能诱导小鼠产生对HEV特异性免疫应答。结论 重组杆状病毒可高效表达HEV ORF3基因片段，表达产物具有HEV特异的免疫原性。

戊型肝炎病毒ORF2片段与ORF3嵌合重组抗原的纯化与免疫学性质

目的 考察具有多个优势抗原表位区段嵌合表达的戊型肝炎病毒（HEV）重组抗原的免疫学性质。方法 将构建的含有3个不同HEV抗原表位基因(ORF2．1: 6287 ～ 6403nt, ORF2．2: 6743 ～ 7126nt, ORF3)的表达质粒pThioHisORF(2．1＋2．2＋3 )在大肠杆菌中进行异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达，其表达产物P_(2．1＋2．2＋3 )在8 mol/L尿素下经阳离子柱SP Sepharose FF层析纯化，透析复性。以P_(2．1＋2．2＋3 )免疫家兔和小鼠, 通过ELISA检测实验动物血清及戊型肝炎患者阳性血清IgG抗体，以Western蛋白印迹检测动物免疫血清对杆状病毒系统表达的抗原片段及嵌合抗原P_(2．1＋2．2＋3 )对患者阳性血清的免疫反应性。结果 纯化的抗原纯度达90%以上；免疫动物血清中检测到特异性抗体的滴度分别为1∶25 600（家兔）和1∶12 800（小鼠）以上，抗血清能够特异识别杆状病毒系统表达的HEV抗原片段，P_(2．1＋2．2＋3 )能与患者阳性血清特异反应。结论 嵌合表达的HEV重组抗原P_(2．1＋2．2＋3 )具有良好的免疫原性和免疫反应性，为进一步研究开发HEV诊断试剂盒及基因工程疫苗提供了基础。

分泌型乙型肝炎病毒包膜M蛋白在毕赤酵母中的表达

将乙肝病毒包膜中蛋白M基因插入酵母整合型表达质粒pAO818的醇氧化酶 (AOX1)启动子下游 ,构建携带 8拷贝M表达盒的重组载体 ,经电穿孔转化SMD116 8菌株和G4 18筛选 ,得到了高效分泌表达M蛋白的毕赤酵母菌株 ,表达量超过 5 0mg L .经初步纯化 ,对表达产物的性质鉴定表明 ,重组蛋白具有preS2和S抗原性 ,可以形成颗粒 ,并具有一定程度的糖基化 .所构建的稳定重组菌株和所得到的重组蛋白颗粒 ,为进一步研究新一代的疫苗提供了必要的材料 .

重组hTRAIL腺病毒载体的构建及鉴定

目的构建表达hTRAIL基因的重组腺病毒载体。方法以重组质粒pThioHisA-TRAIL中提取的TRAIL基因为模板,采用PCR法扩增基因片段。将扩增的基因片段插入穿梭质粒pShuttle-CMV,并转化大肠肝菌DH5α。筛选重组质粒pShuttle-CMV-TRAIL,电转化已转化了pAdEasy-1的BJ5183细胞。筛选重组腺病毒质粒pAdEasy-TRAIL,用Lipofectamine转染293细胞,制备携带人全长TRAIL基因的重组复制缺陷型腺病毒(Ad-TRAIL)。氯化铯密度梯度离心法纯化Ad-TRAIL病毒颗粒,并测定病毒滴度。采用RT-PCR法检测TRAIL基因在293细胞中的转录。以Ad-TRAIL转染YTMLC细胞,采用免疫荧光法和流式细胞术检测TRAIL基因的表达。结果纯化后的Ad-TRAIL病毒颗粒数为2.77×1012VP/ml,感染性滴度为109.5(3.2×109)CCID50/ml。经RT-PCR扩增出约843bp的基因片段,与目的片段大小一致。流式细胞术和免疫荧光法均检测到TRAIL在YTMLC细胞中的表达,表达产物主要存在于细胞质中。结论已成功构建了表达hTRAIL重组腺病毒载体,为肿瘤的基因治疗提供了依据。

轮状病毒P[2]G3株在人二倍体细胞KMB17上的适应性

目的探讨轮状病毒P[2]G3株在人二倍体细胞KMB17上的适应性。方法轮状病毒P[2]G3株在猴肾细胞MA104上经蚀斑筛选纯化后,得到的克隆以不同MOI接种至人二倍体细胞KMB17上。用微量滴定法与蚀斑法平行检测病毒滴度,用免疫荧光法检测病毒的增殖情况,最后进行病毒基因组稳定性检测。结果经MA104细胞培养的轮状病毒P[2]G3株在人二倍体细胞KMB17上可产生明显的细胞病变(CPE),但病变出现的时间随病毒传代次数的增加而延迟,抗原性也逐渐减弱。通过蚀斑筛选纯化得到的克隆病毒,可在KMB17细胞上稳定地增殖。以0.05MOI病毒量接种可产生稳定的CPE,时间为72～96h。连续传代至第10代,病毒滴度达105.5PFU/ml,病毒基因组稳定。结论轮状病毒P[2]G3株在人二倍体细胞KMB17上表现出毒力及增殖能力的衰退;经蚀斑筛选纯化可获得毒力较强的病毒株,并在KMB17细胞中稳定复制、增殖。

huGM-CSF(9-127)-IL-6(29-184)融合蛋白基因的构建及表达

目的构建及表达具有huGM-CSF和huIL-6双重生物学活性的huGM-CSF(9-127)-IL-6(29-184)融合蛋白分子。方法应用PCR技术对huGM-CSF和huIL-6的基因分别加以改造,同时在二者之间加上连接肽序列(G-G-S-G-S)3,克隆PCR产物,并构建成pBV220-GM-CSF(9-127)-IL-6(29-184)表达质粒,表达质粒导入E.coliDH5α中诱导表达。通过QSepharoseH.P.离子交换柱和SephacrylS-200分子筛柱二步柱纯化以获取目的蛋白。使用huGM-CSF依赖细胞株TF1和huIL-6依赖细胞株B9通过MTT法测量融合蛋白的生物学活性。结果pUC18-GM-CSF(9-127)-IL-6(29-184)的测序结果表明,其序列与理论设计完全一致,表达质粒在E.coliDH5α中得到高效表达,表达的融合蛋白占总蛋白含量的25%以上,表达产物以包涵体的形式存在,通过QSepharoseH.P.离子交换柱和SephacrylS-200分子筛柱二步柱纯化及复性后获得目的蛋白,其纯度达到95%以上。融合蛋白具有huGM-CSF和huIL-6的双重生物学活性,其促进huGM-CSF依赖细胞株TF-1和huIL-6依赖细胞株B9增殖的比活性分别为1.08×108U/mg和1.95×107U/mg。结论获得了具有较高纯度和双重生物学活性的GM-CSF(9-127)-IL-6(29-184)融合蛋白。

4种重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子/白细胞介素-6融合蛋白对环磷酰胺引起的小鼠白细胞减少的恢复作用

目的探讨 4种重组人粒细胞 巨噬细胞集落刺激因子 /白细胞介素 6 (rhGM CSF/IL 6 )融合蛋白在小鼠体内的生物学活性 ,观察它们对环磷酰胺所致Balb/c系小鼠白细胞减少及造血功能损坏的影响。方法给小鼠注射环磷酰胺建立实验模型 ,分别同时注射融合蛋白 7d ,于第 13天摘除眼球采血 ,并进行外周血白细胞计数 ,骨髓有核细胞、单个核细胞记数及CFU GM的测定。结果 4种rhGM CSF/IL 6融合蛋白用药组与生理盐水对照组相比 ,小鼠外周血白细胞数 ,骨髓有核细胞和单个核细胞数以及骨髓CFU GM数均有所增加。结论 4种rhGM CSF /IL 6融合蛋白对环磷酰胺所致小鼠外周血白细胞数减少 ,骨髓有核细胞、单个核细胞数和骨髓CFU GM数减少以及造血功能的损坏具有不同程度的恢复作用。

幽门螺杆菌在胃和口腔中感染的检测

目的 :检测在胃和口腔样品中幽门螺杆菌的感染。方法 :采用脲酶实验及 PCR方法检测幽门螺杆菌。结果 :脲酶试验检测不到幽门螺杆菌在口腔中的感染 ,而使用 PCR却有很高的检出率。使用同种引物 PCR对胃粘膜样品和口腔样品的培养液进行检测 ,胃中的检出率不如口腔中的高。结论 :两种检测方法 ,以 PCR更为特异、灵敏。口腔是幽门螺杆菌的重要寄居场所。