膜片钳技术在生物医学研究中的联合应用及其发展趋势

膜片钳技术是研究离子通道电活动的“金标准”,不仅用于研究生理和病理条件下细胞膜离子通道电生理特性和膜电位的变化,还广泛应用于分析药物作用离子通道机制、优化化合物结构以及评价药物毒性等方面。目前,膜片钳技术已成为现代细胞电生理学研究的常规方法,广泛应用于神经科学、心血管科学、药理学、细胞生物学等领域并取得了丰硕的研究成果。近年来,随着基因组学、光遗传学、质谱技术和芯片技术等的不断涌现和日益完善,这些新技术与膜片钳技术的联合应用极大促进了以离子通道为靶点的药物研发和对疾病发病机制的深入理解,进一步拓宽了生命现象的研究维度,促进了生命科学研究的发展。

可诱导稳定表达大电导钙激活钾通道的细胞系构建及蛋白质纯化

目的:旨在构建稳定表达人大电导钙激活钾通道(BK_(Ca))的稳定细胞系并对重组蛋白分离纯化。方法:利用基因工程技术将人肠系膜动脉平滑肌BK_(Ca)编码基因克隆到表达载体pcDNA5/FRT/TO/FLAG,并转染Flp-InTMT-RExTM-293宿主细胞,用潮霉素B筛选建立稳定表达的单克隆细胞系。BK_(Ca)-pcDNA5-293细胞系经四环素诱导后,用anti-FLAG抗体对表达的BK_(Ca)蛋白质进行纯化。用western blot检测BK_(Ca)通道蛋白质的表达,用单通道膜片钳检测通道的电生理特性。结果:BK_(Ca)-pcDNA5-293细胞系经四环素诱导后表达了高水平的BK_(Ca)-FLAG融合蛋白,BK_(Ca)通道电导值为213.39±9.52pS(n=15,cell-attached)和225.72±10.61pS(n=13,inside-out),BK_(Ca)通道具有典型的大电导特性、电压依赖性、Ca2+依赖性及IbTX敏感性,与在体的人肠系膜动脉平滑肌BK_(Ca)通道具有相同的特征。纯化后的BK_(Ca)蛋白质条带单一,纯度约为89%。结论:成功构建BK_(Ca)-pcDNA5-293细胞系并获得纯化的BK_(Ca)蛋白质,为进一步深入研究通道功能及药物筛选奠定了重要的基础。

光学标测技术评价异丙肾上腺素诱导的应激性心肌病小鼠心脏电活动

目的 筛选异丙肾上腺素(ISO)诱导应激性心肌病(SIC)模型小鼠的最佳方案,建立光学标测技术评价SIC对小鼠心脏电活动影响的方法。方法 选择6~8月龄雌性C57BL/6J小鼠60只,分为对照组10只,其余50只根据ISO剂量不同分为给药1组,给药2组,给药3组,给药4组,给药5组,每组10只;另取C57BL/6J小鼠20只,腹腔注射300 mg/kg ISO模型成功的10只作为SIC组。比较各组不同给药时间(6、12 h)对SIC模型小鼠心功能的影响,包括左心室短轴缩短率(LVFS)、LVEF、左心室前壁厚度、左心室后壁厚度、左心室内径。采用光学标测技术检测小鼠心脏动作电位时程复极80%时间(APD80)、传导速度、100%组织激动时间(AT100)评价心脏电活动。结果 给药3组、给药4组ISO诱导SIC模型成功率为60%~70%,明显高于给药1组、给药2组。对照组和SIC组心尖部LVEF和LVFS明显高于心底部,差异有统计学意义(P<0.01);SIC组心尖部和心底部LVEF和LVFS明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.01)。SIC组电刺激时心尖部和心底部APD80较对照组明显延长,差异有统计学意义(P<0.01)。SIC组电刺激时心尖部传导速度明显低于心底部,AT100明显大于心底部,差异有统计学意义(P<0.01);SIC组ISO+电刺激时心尖部传导速度明显低于心底部[(67.84±7.30)ms vs(115.30±5.98)ms,P<0.01],AT100明显大于心底部[(6.67±1.54)ms vs(4.17±0.66)ms,P<0.01]。结论 SIC导致小鼠心底部和心尖部LVEF、LVFS、APD80、传导速度及AT100不均一变化可能是SIC发病机制之一。

生物节律钟基因参与心肌缺血再灌注损伤机制的研究进展

生物节律(biological rhythm)系统由位于下丘脑视交叉上核的中枢时钟和各种组织的外周时钟组成,负责协调机体生理功能,在维持正常的生命活动中具有重要意义。生物节律系统通过神经体液等方式参与心脏功能调控,而机体生物节律紊乱与心血管疾病发生密切相关。近年来,大量研究表明心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia-reperfusion injury)程度具有明显的昼夜差异,缺血再灌注损伤后心脏的不良重构和功能障碍与生物节律钟基因相关,但其确切机制尚未明确。因此,本文就生物节律钟基因在心肌缺血再灌注损伤发生机制中的作用进行综述,为探索心肌缺血再灌注损伤的防治新策略提供理论依据。

K^(+)和Ca^(2+)通透性离子通道调控血管干细胞作用的研究进展

干细胞具有自我更新和多向分化潜能,参与维持机体稳态、组织修复和再生过程。近年来研究发现血管上存在多种不同类型的血管干细胞,被特定条件激活可分化为内皮细胞和平滑肌细胞,参与血管损伤后修复和结构功能重塑。离子通道是生物电信号产生的基础,是细胞与周围环境进行物质交换和信息交流的门户,在维持细胞正常形态和功能调控中发挥重要作用。但目前对血管干细胞离子通道的研究相对较少。K^(+)和Ca^(2+)是细胞内的重要信号分子,通透K^(+)和Ca^(2+)的离子通道协调调控生理和病理状态下血管的舒缩活性和功能重构。最新研究表明,这些离子通道参与调控干细胞的增殖、迁移和分化,预示其在血管干细胞的生物学活性调控中具有潜在作用。本文将对血管上主要分布的可通透K^(+)和Ca^(2+)的离子通道在干细胞中作用的研究进展进行综述,揭示这些离子通道对干细胞生物学活性调控的作用机制,进一步探讨在血管干细胞的增殖、迁移和分化过程中这些离子通道的结构重塑和电重塑机制,为心血管疾病的防治和靶向性药物的研发提供参考。

青年与老年小鼠室性心律失常易感性比较

目的比较青年与老年小鼠在程序性电刺激下诱发室性心律失常的易感性,为后续老龄化相关心律失常研究奠定基础。方法分别对C57BL/6J青年小鼠(8~12周龄)和老年小鼠(16+月龄)做体表心电图和程序性电刺激,观察其室性心动过速(ventricular tachycardia,VT)的发生情况。通过小鼠心脏超声检测相关心功能指标,并用光学标测方法测量心室肌电位和Ca^(2+)变化。结果与青年小鼠相比,老年小鼠的R-R间期延长,电刺激和ISO诱导VT发生率增加,差异有统计学意义(P<0.01)。心脏超声提示,与青年小鼠相比,老年小鼠的射血分数(ejection fraction,EF)降低、缩短分数(fractional shortening,FS)降低、左室舒张期末后壁厚度(end-diastolic left ventricular posterior wall thickness,LVPWd)增加,差异均具有统计学意义(P<0.01)。组织形态学显示,与青年小鼠相比,老年小鼠心重胫骨长度比值增大、心肌细胞横截面积增大、胶原容积增加,差异均具有统计学意义(P<0.001)。光学标测结果显示老年小鼠动作电位及钙瞬变时程延长,差异具有统计学意义(P<0.05),在电刺激及ISO刺激下老年小鼠出现明显的电传导折返,提示老年小鼠心脏电传导异常,易发心律失常。结论与青年小鼠相比,老年小鼠心脏组织形态改变和心功能下降,尤其是增龄导致的心脏电生理的改变,增加了老年小鼠心律失常的易感性。

恩格列净通过剂量依赖性调控自噬对心肌梗死大鼠室性心律失常的影响

目的 探究钠-葡萄糖共转运蛋白2抑制剂恩格列净(empagliflozin,EMPA)对心肌梗死大鼠室性心律失常(ventricular arrhythmias,VAs)的影响及其可能机制。方法 采用结扎雄性非糖尿病SD大鼠左冠状动脉前降支的方法建立心机梗死(myocardialinfarction,MI)模型,将其分为MI组、low-EMPA组(10 mg/kg·d)和high-EMPA组(30 mg/kg),Sham组不行冠脉结扎术,只行开胸术。药物连续干预4周后行超声心动图、burst刺激检测VAs诱导率,HE染色观察心肌形态,western blot检测自噬相关蛋白P62、Beclin-1、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ。结果 (1)心脏彩超:与Sham组相比,MI组大鼠左室前壁厚度(LVAWT)、室间隔厚度(IVST)、射血分数(EF)明显降低(P <0.05),左室舒张末期内径(LVEDD)、左室收缩末期内径(LVEDS)明显升高(P <0.05),左室后壁厚度差异无统计学意义(P> 0.05)。与MI组相比,low-EMPA组和high-EMPA组大鼠LVAWT、IVST、EF显著升高(P <0.05),LVEDD、LVEDS显著降低(P <0.05),LVPWT差异无统计学意义(P> 0.05)。与high-EMPA组相比,low-EMPA组LVAWT、LVPWT、EF没有统计学差异(P> 0.05),IVST明显增加(P <0.05),LVEDS、LVEDD明显降低(P <0.05)。(2)VAs发生情况:与Sham组相比,MI组大鼠VAs得分明显升高(P <0.05);与MI组大鼠相比,low-EMPA组和high-EMPA组大鼠VAs得分明显降低(P <0.05),其中high-EMPA组Vas得分降低更明显,但与low-EMPA组相比差异无统计学意义(P> 0.05);(3)Western blot:与Sham组相比,MI组P62表达增加(P <0.05),Beclin-1、LC3Ⅱ表达降低(P <0.05);与MI组相比,low-EMPA组和high-EMPA组P62表达降低(P <0.05),Beclin-1、LC3Ⅱ表达增加(P <0.05);与low-EMPA组相比,high-EMPA组P62表达降低(P <0.05),Beclin-1、LC3Ⅱ表达增加(P <0.05)。结论 EMPA可剂量依赖性改善心肌梗死大鼠VAs的诱导率,其机制可能是改善心功能及心脏结构重构、激活心肌细胞自噬。

一种改良的原代大鼠乳鼠心肌细胞分离及培养方法

目的:本研究旨在探讨一种经改良后既稳定又高效的分离大鼠乳鼠心肌细胞的原代分离和培养方法,拟建立此种方法,为进一步研究单个心肌细胞上的各种电生理机制等诸多实验提供有利的前提保障。方法:取出生1-3天内SD大鼠心脏,联合应用胰蛋白酶和Ⅱ胶原酶两步消化,离心收集到心肌细胞,差速培养,加入5-溴脱氧尿嘧啶核苷纯化后得到原代心肌细胞,经高糖DMEM培养,即可得到立体感较强的大鼠乳鼠心肌细胞。结果:联合应用胰蛋白酶和Ⅱ胶原酶两步消化,经过高糖DMEM培养后得到的心肌细胞存活率高、纯度高、折光性好、立体感较强,有节律性搏动。结论:成功建立了一种既简便高效又稳定的分离大鼠乳鼠心肌细胞的方法,为今后研究乳鼠心肌细胞的功能及其基本电生理特性提供良好的单个细胞,可广泛应用于各种心血管疾病的研究中。

长QT综合征的研究新进展

长QT综合征(long QT syndrome,LQTS)是一种遗传性心律失常综合征,与尖端扭转型室性心动过速(torsade de pointes, TDP)导致的心源性猝死有关。在美国每年约有4 000例猝死是由于长QT综合征,好发于儿童和青少年。由于发病年龄小,对家庭和社会影响巨大,全面详细的了解最新长QT综合征的研究情况,对不同亚型长QT综合征患者的治疗提供新思路。此文就最新长QT综合征的临床分型、发生机制、电生理学、临床治疗及其亚型研究新进展做一综述。

人肠系膜血管平滑肌细胞BK_(Ca)通道在HEK293细胞上的表达方法研究

目的:本研究旨在HEK 293细胞系上成功表达人肠系膜血管平滑肌细胞大电导钙激活钾通道(large-conductance calcium-activated potassium channels,BKCa),建立一种稳定高效表达人肠系膜血管平滑肌细胞BKCa的HEK 293细胞系方法,进一步揭示在工具细胞表达上的BKCa的基本特性,为以后的诸多实验提供参考价值。方法:应用基因工程技术构建人肠系膜血管平滑肌细胞BKCa通道基因表达载体,用脂质体转染法转染HEK 293细胞,建立了稳定高效表达BKCa通道的HEK 293细胞系的方法。结果:在HEK 293细胞系上表达的BKCa单通道电流的电导值为229.56±4.62 p S,具有电压依赖性,钙离子敏感性等特性;在HEK 293细胞系表达的BKCa全细胞宏观电流具有明显的电压依赖性和外向整流特性。结论:成功建立了一种在HEK293细胞系上表达的BKCa通道的实验方法,并成功记录到BKCa通道的单通道电流和全细胞宏观电流,且与天然细胞上BKCa通道电流特性基本一致。

温度敏感型离子通道基因在哺乳动物内脏器官和血管中的表达研究

温度敏感型离子通道广泛存在于哺乳动物内脏器官和血管组织,在多种生理功能的调节中起重要作用。本研究以雄性比格犬和雄性SD大鼠的心脏、肝、脾、肾、肺、主动脉、肺动脉、肺静脉、股动脉、股静脉及颈总动脉为材料提取RNA,经逆转录PCR以及半定量方法获得这些通道基因的表达情况。结果显示:TRPV1在2种动物的上述组织中均有表达,而TRPV2和TRPM5在所有组织中均无表达;TRPV3仅表达在大鼠的肝、肺及肺动脉中,在狗的所有组织中均无表达;TRPV4在狗的肺中无表达,在2种动物的其他组织中均有表达;TRPM2在大鼠的主动脉、心脏、肺动脉中无表达,在2种动物的其他组织中均有表达;TRPM3在狗的肺、肺动脉及大鼠的肺、心脏、主动脉中无表达,在2种动物的其他组织中均有表达;TRPM4在狗的肺动脉以及大鼠的脾、肾、心脏中没有检测到表达,在2种动物的其他组织中均有表达;TRPM8在狗的肝、脾、肾以及大鼠的肾中无表达,在2种动物的其他组织中均有表达;TRPA1仅在大鼠的肺和脾中有表达。本研究比较全面地展示了温度敏感型离子通道基因在哺乳动物内脏器官和血管中的表达情况,为进一步探究其在哺乳动物生理调节中的功能奠定基础。

基于网络药理学的马齿苋治疗动脉粥样硬化作用机制研究

目的:基于网络药理学方法探究马齿苋治疗动脉粥样硬化的作用机制。方法:通过TCMSP (Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform)数据库获取马齿苋的活性成分及作用靶点,根据ADME筛选其主要活性成分,通过String平台进行分析并利用Cytoscape3.7.2软件构建马齿苋主要活性成分与作用靶点的网络;收集Disgenet、OMIM、Drugbank数据库中动脉粥样硬化的靶点,通过String平台进行马齿苋与动脉粥样硬化共同靶点相互作用分析并利用Cytoscape3.7.2软件构建其PPI网络;采用Metascape平台进行“药物–成分–靶点”的基因功能与通路分析,通过CB-DOCK进行分子对接验证。结果:马齿苋的主要活性成分为槲皮素、山柰酚、木犀草素等10个,对应212个作用靶点。动脉粥样硬化有关的靶点1081个。马齿苋成分–动脉粥样硬化共同靶点有ALB、IL-6、TNF等108个,主要通路有流体剪切力与动脉粥样硬化途径、癌症的途径、TNF信号通路等。槲皮素、山柰酚、木犀草素分别与ALB、IL-6的对接得分均【−5 kcal/mol,说明它们之间的分子对接能力均较好。结论:马齿苋通过多成分、多靶点、多通路参与动脉粥样硬化的调节。

单细胞测序技术及其在心血管研究方面的应用

单细胞测序在单个细胞水平研究细胞异质性以及生物多样性。与传统测序研究群体细胞基因的平均变化相比,充分展现了单个细胞间的差异性。近几年来,单细胞测序技术为单个细胞水平研究细胞命运谱系、动态分析细胞异质性、寻找心血管疾病治疗的新靶点、明确干细胞移植标准等提供了有力的帮助。本文介绍了单细胞测序的主要类型,并结合其在心血管研究方面的应用进行了综述。

抗肿瘤药的心脏毒性

本文主要阐明抗肿瘤药如蒽环类药物、烷化剂、抗细胞微管剂、抗代谢类药物及单克隆抗体、小分子酪氨酸激酶抑制剂的抗肿瘤作用机制及药物的心脏副作用,并简述心脏毒性的监测、预防和治疗方法。

血管壁干细胞迁移及分化机制的研究进展

血管外膜包含多种细胞类型,包括血管壁干细胞(vascular wall-resident stem cells,VRSCs),间充质细胞(mesenchymal stem cells,MSCs),巨噬细胞,成纤维细胞,以及包围外膜滋养血管的周细胞等。近年研究发现,血管壁干细胞具有高增殖能力和多向分化潜能。在静息状态下,血管壁干细胞主要参与血管细胞的自我更新和稳态调节;血管损伤后,它们迁移到血管损伤部位,通过旁分泌途径或分化为内皮细胞、平滑肌细胞等,参与血管损伤修复、血管重构和血管功能的调节。血管壁干细胞一方面可以促进损伤血管的修复,另一方面又可导致血管再狭窄、加重动脉粥样硬化病变。因此,了解血管壁干细胞的迁移、分化机制,有助于在心血管疾病中开发新的干细胞治疗策略。

风湿性心脏病合并房颤患者Lnc RNA差异性表达研究

目的:探讨风湿性心脏病合并心房颤动患者右心耳组织中LncRNA表达变化,为进一步研究心房颤动发生机理提供实验依据。方法:选择风湿性心脏病合并心房颤动患者5例和风湿性心脏病未合并有心房颤动患者5例,外科手术中切下的右心耳组织作为实验样本,分别作为实验组及对照组,采用高通量基因芯片技术检测,获得LncRNA和mRNA差异表达数据,对差异表达的m RNAs进行GO、KEGG等初步生物信息学分析。结果:与对照组LncRNA基因表达谱相比,实验组LncRNA表达水平显著上调有119个(其中有9个Fold change>4倍),表达水平下调有214个(其中有14个Fold change>4倍);Go分析结果中,生物学过程差异基因富集条目169条,细胞组分差异基因富集条目18条,分子生物学差异基因富集条目89条;KEGG分析显示,受差异基因调控通路共18条。结论:LncRNA在房颤患者右心耳组织中存在差异表达,提示LncRNA可能参与房颤发生与发展的调控,并将为进一步研究提供实验依据。

阿霉素致心肌线粒体损伤的分子机制研究进展

阿霉素属蒽环类抗肿瘤药,是临床上最有效的抗癌药之一,但其会导致心脏功能的改变和其他器官的损害。由于心肌细胞很难分裂增殖,绝大多数损伤不可逆,很难逆转对心功能的影响。心脏的氧化新陈代谢较快,抗氧化防御水平较低。因此,心脏对自由基引起的损伤很敏感。阿霉素可导致剂量依赖性心肌病和充血性心力衰竭;还可能会发生认知功能的持续性变化(记忆力和注意力丧失以及难以执行多项任务)。阿霉素导致的剂量依赖性心肌病还可导致明显的低血压、心动过速、心脏扩张和心室衰竭。因此,探讨阿霉素诱导心脏毒性作用机制具有重要意义。许多研究试图描述和阐明其心脏毒性作用的机制,尽管有丰富的数据涵盖了抗肿瘤药物阿霉素产生的广泛影响,但确切的机制仍然存在争议。许多研究发现无论是急性还是慢性,线粒体均是阿霉素诱导的氧化应激的主要靶点。本文就阿霉素损伤线粒体导致心脏毒性的分子机制作一综述。

人食道癌相关基因-4在天然免疫及炎症反应中的潜在功能

人食道癌相关基因-4(esophageal cancerrelatedgene-4,ECRG4,又名C2ORF40)是一个特殊的肿瘤抑制基因。生物信息学分析显示ECRG4基因在不同物种间高度保守,并且ECRG4在体内具有广泛的组织分布,提示其生理功能的多样性。近年来的研究表明,ECRG4基因编码一种激素样前肽(Ecrg4)。Ecrg4不仅仅具有传统的肿瘤抑制功能,而且参与多种生理及病理过程的调控,其中包括对炎症反应的调节,但Ecrg4调节炎症反应的具体作用机制尚不明确。本文将对ECRG4的发现、分布、表达特点及肿瘤抑制作用进行概括,并重点讨论Ecrg4在天然免疫及炎症反应中的作用。

Junctophilin-2在心肌肥大及心衰中作用机制的研究进展

Junctophilin-2(JP2)是心肌细胞膜横向(T)-小管与肌浆网上兰尼碱受体RyR2之间形成的膜耦联复合物(JMCs)主要结构蛋白之一。当JP2出现基因突变、蛋白表达下调以及结构空间紊乱等功能异常时,会引发一系列如心肌肥大、原发性心肌病、心房颤动、心力衰竭等心脏疾病的产生。心肌肥大是大多数心脏疾病发生时的一种强有力的代偿形式,若不能改善,则易转变为心力衰竭,而心力衰竭又是大多数心肌病的终末状态,故本文对JP2在心肌肥大和心衰中的作用机制做一综述。

特殊作息职业人群生物节律检测技术研究进展

生物钟是由自我维持的昼夜节律振荡器和环境、行为等共同驱动的,它协调机体生理功能和行为,对健康至关重要。机体内部的生物钟受许多因素的影响。对于特殊作息职业人群,因作息时间不规律,易出现生物节律紊乱,从而引起失眠、抑郁等多种身心疾病。因此检测机体内部生物节律有助于理解在不同因素作用下的特殊作息职业个体间差异并指导时间治疗法。既往评估机体内在昼夜节律的方法主要通过不同时间点采集外周标记物(如褪黑素、钟基因等)来完成,但这些方案耗时长、实用性欠佳。随着实验技术手段的进步,已有多种检测机体内在节律的新方法,它们基于机器学习或数学模型的特征分析,即从高维数据样本中提取特征,如转录组、代谢组等,从而评估身体内部生物钟。回顾并总结了这些方法,并对它们的应用前景进行了分析。这些新方法为简化特殊作息职业人群昼夜节律的检测手段和时间治疗学的发展提供了新的助力。