心房肌胞内钙浓度变化对心房颤动患者小电导钙激活钾通道电流的影响

目的:SK通道存在于心肌细胞上,其中SK2亚型主要表达在心房。SK2通道对胞内游离钙离子高度敏感,可快速将钙离子浓度的变化转换成细胞膜电位变化。本实验应用穿孔膜片钳技术记录人心肌细胞SK2电流,观察心房肌细胞SK2电流在窦性患者和心房颤动患者之间的差别,以及电极液中不同的钙浓度对两组细胞SK2电流的影响。方法:将接受体外循环手术的患者分为两组:心房颤动组和窦性心律组。以心房肌细胞为研究对象,用穿孔膜片钳技术记录人心肌细胞电流,观察窦性组与房颤组SK2通道电流的差异以及两组细胞SK2电流对电极液中钙敏感性的不同。结果:在全细胞穿孔膜片钳模式下,电极液中游离钙离子浓度为5×10-7mol/L时,记录到房颤组SK2通道电流明显大于窦性组,尤其是在超极化水平。膜电位在-130 mV时,窦性组与房颤组的SK2通道电流密度分别为(-2.92±0.35)pA/pF(n=6),(-6.83±0.19)pA/pF(n=3,P<0.05)。在电极液游离钙离子浓度分别为0 mol/L、5×10-7mol/L、10-6mol/L,膜电位为-130 mV时,窦性组SK2通道电流密度分别为(-1.43±0.33)pA/pF(n=7),(-2.92±0.35)pA/pF(n=6),(-10.11±2.15)pA/pF(n=8,P<0.05);房颤组SK2通道电流密度分别为(-2.17±0.40)pA/pF(n=4)(-6.83±0.19)pA/pF(n=3)(-14.47±2.89)pA/pF(n=4)(P<0.05)。结论:人心房肌细胞SK2通道具有电压不敏感、内向整流、apamin敏感的特性。电极液中钙浓度相同的情况下,房颤组的SK2电流密度明显大于窦性组,SK2通道电流对钙离子的敏感性高于窦性组,提示SK2通道钙敏感性增加可能与心房颤动的发生发展密切相关。

二性霉素B与β-escin混合穿孔电极液在人心房肌细胞SK2电流记录中的应用

目的:为研究钙离子对人心房肌细胞小电导钙激活钾通道电流(ISK2)的调节作用,建立用二性霉素B(amphotericin B)与β-escin穿孔的膜片钳(PPR)技术。方法:体外循环术中取得右心耳,应用急性酶分离获得单个人体心房肌细胞,用二性霉素B和/或β-escin作为穿孔电极液,进行穿孔膜片钳实验,在此模式下测试钙离子对人心房肌细胞SK2电流的调控作用,并用胞内钙测试系统验证穿孔前后胞内钙变化。结果:混合使用穿孔电极液6.88μg/mlβ-escin和150μg/ml二性霉素B与单独用150μg/ml二性霉素B或6.88μg/mlβ-escin相比,前一种方法细胞容易封接,能形成稳定的穿孔膜片钳记录模式,可观察到SK2电流有激活,且胞内钙测试系统检测时可观察到穿孔后电极液至细胞内的游离钙离子浓度的增加,F340/380增强。结论:适当浓度的二性霉素B与β-escin混合使用进行穿孔膜片钳实验是一种稳定的全细胞膜片的记录技术,可以用于胞内游离钙离子对SK2电流调控的研究。

蛋白激酶A在慢性心房颤动患者2型小电导钙激活钾通道调控中的作用

目的:探讨心房颤动(AF)时心房肌细胞2型小电导钙激活钾通道(SK2通道)功能的改变及蛋白激酶A(PKA)相关途径对SK2通道电流的调节。方法:从体外循环手术中获取右心耳组织,应用改良的急性酶分离法获得人心房单个心肌细胞,采用膜片钳全细胞记录模式进行SK2通道电流记录。对比窦性心律(SR)组和AF组SK2通道电流密度及其在混合电流中所占比例的变化。观察PKA特异性抑制剂H-89对SK2通道电流的作用。采用BCA法和ELISA法检测心房组织总蛋白和PKA的含量。结果:(1)SR组和AF组的SK2通道电流均呈现内向整流特性。AF组SK2通道电流密度明显增高,且在混合电流中所占比例增加。在-130 mV钳制电压下,SR组和AF组SK2通道电流密度分别为(-2.61±0.14)pA/pF和(-6.21±0.59)pA/pF,在混合电流中所占比例分别为(20.01±1.44)%和(42.87±1.79)%,差异均有统计学意义(P<0.05)。(2)H-89能够降低SR组和AF组SK2通道电流密度,且对AF组SK2通道电流密度的抑制更明显。在-130 mV钳制电压下,H-89对SR组和AF组SK2通道电流密度的抑制率分别为(39.27±4.08)%和(76.32±2.94)%;SK2通道电流在混合电流中比例亦下降,抑制率分别为(37.48±4.77)%和(56.40±3.66)%,差异均有统计学意义(P<0.05)。(3)AF使PKA含量下降。SR组和AF组PKA含量分别为(511.91±7.22)ng/L和(444.09±7.88)ng/L,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:AF患者心房肌细胞SK2通道电流密度及其在混合电流中比例升高,是AF发生和维持的基础之一,电流改变参与了心房电重构过程。PKA能够通过一定途径调节SK2通道功能,且对AF心房肌细胞SK2通道的调节更为显著。

重叠PCR法构建人心房肌SK2(KCNN2)基因表达质粒及鉴定和序列分析

目的:小电导钙激活钾通道亚型2(SK2)在心房肌功能活动中起重要作用,但是由于其表达密度低,直接进行RT-PCR一步法无法得到该基因(KCNN2)的编码区全长序列,本研究旨在采用Overlapping PCR(重叠PCR)法进行基因全长序列的扩增和表达质粒的构建,探讨其在长片段基因扩增的应用。方法:收集人心房肌标本,采用提取总RNA之后逆转录为cDNA,分三段设计KCNN2基因(AY258141)引物进行分段扩增,同时进行分段测序,然后采用Overlapping PCR得到KCNN2基因编码区全长序列,通过限制性酶切位点定向克隆到表达载体pIRES-hrGFP上。采用酶切法和测序法进行鉴定。结果:三段KCNN2基因扩增产物大小与预测值一致,最后得到的表达质粒测序结果与基因库数据基本一致。结论:成功构建人心房肌SK通道基因表达质粒pIRES-hrGFP-SK2,Overlapping PCR能够很好的用于长片段基因扩增。

人心房肌蛋白激酶C表达下调参与心房颤动发病机制

目的:研究心房颤动(atrial fibrillation,AF)时心房肌组织中PKCα、δ、ε、θ4种亚型mRNA和PKC总蛋白的表达变化,探讨PKC与AF发生发展的相关性。方法:泸州医学院附属医院行体外循环手术患者常规切除的右心耳组织作为研究对象。①实时定量PCR实验:提取人右心耳组织总RNA,β-actin为内参照基因,采用SYBR GreenⅠ法实时荧光定量PCR技术检测SR和AF患者PKCα、δ、ε、θ基因mRNA水平。②western blotting实验:有心耳组织提取总蛋白,测定蛋白浓度,GAPDH作为内参照,SDS-PAGE电泳检测SR和AF患者PKC的蛋白表达变化。结果:①AF患者心房肌细胞PKCα和PKCδ亚基mRNA水平下调;PKCε和PKCθ亚基mRNA水平明显上调。②SR组与AF组PKC总蛋白相对表达量分别为1.37±0.09(n=23)、1.00±0.10(n=18),(P<0.05)有统计学意义。结论:与SR患者相比,AF患者心肌细胞中PKCα、δ亚基mRNA明显下调,PKCε、θ亚基mRNA上调,PKC总蛋白表达降低。PKC亚型mRNA和总蛋白的表达变化可能是参与AF发生发展的分子基础之一。

表达在HEK293细胞上的BK_(Ca)通道基本特性与动力学调控研究

目的构建稳定表达人血管平滑肌大电导钙激活钾通道(BKCa)的293细胞系,并研究其基本电生理学特征和动力学模型。方法通过脂质体(lipofectamine 2000)转染法转染BKCa表达质粒pcDNA3.1-BKα和(或)pIRES-BKβ1,筛选稳定表达的单克隆细胞系。使用膜片钳多种记录方式研究其基本电生理学特性,同时建立BKCa动力学研究模型。结果构建稳定转染BKCa通道α和(或)β1亚单位的HEK293细胞系,通过膜片钳能够记录到具有与天然细胞BKCa电生理学特性相似的电流,包括大电导特性[内面向外式构型下单通道电导为(216.38±3.55)pS]、电压依赖性、Ca2+依赖性、钾离子选择性和200nmol/L IbTX(BKCa特异性阻断剂)阻断;联合表达β1亚单位能够明显增加通道的开放时程。采用inside-out宏观电流记录方式可以记录到明显的尾电流。可以用于分析通道激活、去激活等动力学模型及药物动力学作用机制。结论成功构建稳定转染BKCa通道α和(或)β1亚单位的HEK293细胞系。膜片钳实验证明具有典型的BKCa电生理学特性,同时建立的细胞系可以很好的用于BKCa通道功能调控研究和动力学参数分析。

小鼠脑动脉平滑肌钙激活钾通道基本特性和动力学调控研究

目的采用膜片钳技术记录小鼠脑动脉平滑肌细胞上的大电导钙激活钾通道(BKCa)和自发瞬时外向电流(STOCs),研究了其基本特性以及钙离子对通道动力学的调控。方法采用两步法急性酶分离小鼠脑动脉,得到单个平滑肌细胞。使用200μg/mL两性霉素B为穿孔剂进行穿孔全细胞膜片钳实验,包括全细胞宏观电流记录和STOCs记录,采用inside-out和outside-out构型进行单通道电流记录。结果 BKCa宏观电流和STOCs能够被BKCa的特异性阻断剂IbTX(200nmol)阻断。BKCa单通道具有明显电压依赖性(半数最大激活电压V1/2=78.09mV)、K+选择性和钙敏感性(Ca2+解离常数Kd=0.881μmol),能够被胞外IbTX阻断。胞内Ca2+调控通道动力学特性主要表现为减少了开放时间常数,促进了通道由关闭向开放的转变。结论 BKCa宏观电流和STOCs非常容易记录,单通道活性好,具有BKCa的电生理学特性。小鼠脑动脉平滑肌是研究BKCa功能活动和血管活性药物作用机制的良好实验标本。

人肠系膜动脉平滑肌sGCα和sGCβ基因表达水平检测方法的建立

目的:建立实时荧光定量PCR检测人肠系膜动脉平滑肌sGCα和sGCβ基因表达水平的检测方法,并构建相应质粒标准品,为进一步研究基因功能奠定基础。方法:提取人肠系膜动脉组织总RNA,采用RT-PCR方法获取sGCα、sGCβ、GAPDH基因片段,与pMD-18T vector连接,并转化到大肠杆菌DH5α细胞,通过PCR和测序鉴定重组质粒。提取含目的基因的质粒作为标准品,采用SYBR GreenⅠ法检测人肠系膜动脉平滑肌sGCα和sGCβ基因表达和构建标准曲线。结果:人肠系膜动脉平滑肌存在sGCα和sGCβ基因表达,质粒标准品经过PCR鉴定并测序,与数据库公布的序列完全一致,标准曲线线性关系好,相关系数R2>0.99。结论:建立了稳定的定量检测方法,并成功用于检测人肠系膜动脉平滑肌sGCα和sGCβ基因表达,构建质粒标准品能用于后续实验。

异丙酚对小鼠脑动脉血管平滑肌细胞自发性瞬时外向钾电流的影响

目的探讨异丙酚对小鼠脑动脉血管平滑肌细胞自发性瞬时外向钾电流的影响。方法昆明小鼠，体重18～22g，雌雄不拘，分离脑底部Willis动脉环，经两步法酶消化分离血管平滑肌细胞，选取5个血管平滑肌细胞，采用穿孔全细胞膜片钳技术，于钳制电位为-30mV时记录加入56umol／L异丙酚前后自发性瞬时外向钾电流，分析其幅度、频率、曲线下面积和时间半宽。结果与给药前比较，给药后自发性瞬时外向钾电流的幅度、频率和曲线下面积升高（P〈0．05或0．01），时间半宽差异无统计学意义（P〉0．05）。结论异丙酚可激活小鼠脑动脉血管平滑肌细胞自发性瞬时外向钾电流，诱发血管平滑肌舒张。

蛋白激酶C对心房颤动患者心房肌小电导钙激活钾通道的影响

目的:比较心房颤动(AF)时蛋白激酶C(PKC)对小电导钙激活钾通道(SK)电流的影响,探讨人AF时PKC途径对SK2通道的调节作用。方法:取行体外循环手术患者新鲜的右心耳组织,采用改良的酶分离法获得单个心房肌细胞,全细胞膜片钳模式且电极液中游离钙离子浓度为5×10-7 mol/L时记录SK2通道电流。比较正常的窦性心律组(SR组)和AF组患者心房肌细胞SK2通道电流密度,观察PKC特异性激活剂PMA对SK2通道电流的影响。结果:1AF组SK2通道电流密度明显大于SR组,且AF组SK2通道电流在混合内向电流中所占的比例明显增加;在-130mV膜电压下,SR组和AF组SK2通道电流密度分别(-5.10±0.32)pA/pF(nSR=5)和(-10.71±0.73)pA/pF(nAF=5),P<0.05;SR组和AF组SK2通道电流在混合内向电流中所占的比例分别为(23.20±1.09)%和(32.87±1.81)%(nSR=5,nAF=6),P<0.05。2PKC激活剂PMA降低SR组和AF组SK2通道电流密度及其在混合电流中所占的比例,AF组的抑制比大于SR组;在-130mV电压下,PMA对SK2通道电流的抑制比分别为(8.39±0.80)%和(20.9±0.70)%。结论:AF时SK2通道功能增强,激活PKC后可下调SK2通道电流,且对AF患者SK2的调节作用更显著,推测PKC相关途径对SK2通道的调控参与了心房电重构过程。

不同浓度右美托咪定对大鼠肠系膜动脉平滑肌细胞BK_Ca通道的影响

目的评价不同浓度右美托咪定对大鼠肠系膜动脉平滑细胞大电导钙激活钾通道（BK_Ca）的影响。方法SD大鼠，雌雄不拘，体重180～220g，经两步法酶消化分离肠系膜动脉平滑肌细胞。选取10个肠系膜动脉平滑肌细胞，采用单通道内面向外式膜片钳技术进行记录，钳制电压为40mV，游离钙离子浓度为10～mol／L，采用浓度累积法加入右美托咪定，分别于0（基础值）、10^-9、10^-8、10^-7、10^-6、10^-5mol／L右美托咪定时记录BK_Ca开放概率（NPo）、电流幅度（Am）、平均开放时间（To）和平均关闭时间（Tc）。结果与基础值比较，10^-7、10^-6、10^-5mol／L右美托咪定时NPo升高，且呈浓度依赖性，10^-9、10^-8、10^-7、10-^6、10^-5mol／L右美托咪定时Tc缩短（P〈0．05或0．01）；与10^-9mol／L右美托咪定比较，10^-8mol／L右美托咪定时R缩短（P〈0．05），不同浓度右美托咪定时Am和To差异无统计学意义（P〉0．05）。结论10^-7、10^-6、10^-5mol／L右美托咪定可呈浓度依赖性地激活大鼠肠系膜动脉平滑肌细胞BK_Ca通道，是其降压作用的机制之一。