甲氨蝶呤对映体诱导肺癌细胞耐药后引起血管内皮细胞分化差异的研究

目的研究甲氨蝶呤（MTX）对映体大剂量冲击作用肺癌A549细胞后，MTX对映体耐药细胞血管分化是否具有手性选择性。方法用大剂量冲击法诱导获得A549对映体耐药肺癌细胞，流式细胞双色分析细胞CD44／CD31以及P-170表达；皮下接种裸鼠，成瘤后取瘤体切片，进行CD34组化染色，计数新生微血管密度（MVD）。以A549亲本细胞（未获得耐药）作为对照组。结果分别建立耐药浓度为15μmol／L的L—MTX和D—MTX的A549耐药细胞株；它们与各自对映体的耐药指数分别为12．4±1．2和20．14-2．3；A549亲本细胞、L—MTX耐药细胞和D．MTX耐药细胞中：CD31’阳性率分别为55．5％±9．7％、32．9％±8．O％和91．9％±3．2％，差异有统计学意义（F=511．92，P=0．000）；P-170阳性率分别为85．5％±4．6％、71．5％±8．2％和87．0％±8．9％，L—MTX耐药细胞P-170的阳性率低于D．MTX耐药细胞（t=6．13，P=0．002）；3种细胞植入裸鼠成瘤后切片免疫标记CD34统计新生MVD，A549亲本细胞为3．6±1．2，L-MTX耐药细胞为7．24-1．7，D-MTX耐药细胞为55．9±11．9，D．MTX耐药细胞显著高于L—MTX耐药细胞（t=13．37，P=0．000）。结论MTX对映体诱导肺癌A549耐药细胞向血管内皮细胞分化能力不同，D—MTX耐药细胞经血管转移高于L．MTX耐药细胞，这提示MTX制剂中D型组分不能简单当成污染物而忽视，应尽量选用单-对映体的L-MTX药物制剂，减少D—MTX带来的副作用。

氨甲蝶呤耐药细胞内整体DNA甲基化水平检测方法的建立及其应用

目的建立一种简便快速检测细胞内整体DNA甲基化水平的方法，以用于临床甲基化诊断。方法采用高效毛细管电泳技术，以pH9．6的48mmol／L碳酸氢钠溶液[含60mmoL／L十二烷基硫酸钠（SDS）]为分离缓冲液，检测波长为256nm，在20kV电压下，0．7psi压力进样时间5s，对2’-脱氧胞苷（dC）、5-甲基-2’-脱氧胞苷（mdC）、2’-脱氧腺苷（dA）、2’-脱氧胸苷（dT）、2’-脱氧鸟苷（dG）5种物质进行分离。在此基础上检测氨甲蝶呤（MTX）诱导的肺癌A549耐药细胞株内整体DNA甲基化水平。结果通过不断优化分离缓冲液中SDS浓度（40、60、80mmol／L）、pH值（9．4、9．6、9．8）、分离电压（15、17、19、20、22kV）、进样时间（5、10、15、20、30S）和毛细管温度（15、20、25、30℃），建立高效毛细管电泳检测细胞内整体DNA甲基化水平的方法，可在10min内实现dC、mdC、dA、dT、dG的完全分离，其日内变异系数（CV）〈0．2％，日间CV〈2％，最低检出限为2μmol／L。检测肺癌A549亲本细胞甲基化水平为（4．80±0．52）％；而不同浓度（15、30、40μmol／L）MTX诱导耐药A549细胞株的甲基化水平分别为（4．20±0．44）％、（3．70±0．36）％、（3．10±0．35）％。结论建立高效毛细管电泳检测整体DNA甲基化水平的方法具有高效、快速、简单、灵敏的特点；MTX耐药细胞株内整体DNA甲基化水平随着耐药浓度的增加明显降低。