生物素化荧光素酶的克隆表达及其固定化研究

为了在体内实现萤火虫荧光素酶的生物素酰化修饰,将大肠杆菌中编码生物素羧基载体蛋白(biotin carboxyl carrier protein,BCCP)C端87个氨基酸的功能域基因融合到萤火虫(Pyrocoelia pectoralis)荧光素酶cDNA的末端。经大肠杆菌生物素合成酶(biotin holoenzyme synthetase)的催化,生物素与BCCP上特定的赖氨酸(Lys)残基共价结合,由此与BCCP融合的萤火虫荧光素酶间接实现了生物素化的修饰。利用生物素与配体亲和素或链霉亲和素的特异性耦合,可以将荧光素酶固定到亲和素或链霉亲和素包被的磁珠上,从而使荧光检测的应用更加灵活和方便。讨论了生物素化荧光素酶的克隆、表达以及功能检测。

激光直写技术在微电极阵列制作中的应用研究

利用激光微细熔覆电子浆料（LMCEP）技术在熔融石英玻璃上初步制作了4×4微电极阵列（MEA）——目前研究细胞电生理的常用工具之一，在电极阵列背面利用微笔直写技术直接“写”上加温和热敏电阻，完成了微电极阵列、电热器件和热敏器件的集成制造。随后对电极阻抗和微加热器性能进行了测试，并在其上培养神经细胞。结果表明：激光直写导线宽度与加工电流、光阑直径、电子浆料、涂层厚度和衬底材料相关；电极和微加热器性能基本满足使用需求，但是电子浆料成分对细胞生物活性存在一些影响。今后将更换电子浆料材料，提高生物相容性。

杂合型SNP定量焦测序分析技术在唐氏综合征快速产前诊断中的应用研究

目的：应用杂合型SNP定量焦测序分析技术进行唐氏综合征（DS）的快速产前诊断,并探讨其在临床应用中的可行性。方法：选取21号染色体PLAC4、COL6A2、COL6A1基因的rs1053315、rs818219、rs2839110、rs1042917、rs35548026、rs8130833这6个SNP位点进行研究。对10例正常人和5例DS患者的外周血样本的6个SNP位点进行检测,建立用于诊断DS的杂合型SNP等位基因比值阈值。然后根据建立的阈值,对40例产前诊断样本（35例羊水样本和5例脐带血样本）行定量焦测序分析检测,从而对其21号染色体的情况做出诊断,并用染色体核型分析法验证焦测序检测的结果。结果：（1）等位基因比阈值范围：1.0∶1.0~1.3∶1.0判断为21号染色体二倍体;1.6∶1.0~2.2∶1.0判断为DS;1.3∶1.0~1.6∶1.0或6个位点均为纯合则结果不能判断。（2）定量焦测序分析检测：27例为21号染色体二倍体胎儿;7例为DS胎儿;5例6个SNP位点均为纯合,结果不能判断;1例因PCR扩增失败,未检测出。检测结果均在6~8h内获得,且应用便携式焦测序仪1次可检测8个样本。（3）染色体核型分析检测：33例为21号染色体二倍体胎儿,7例为DS胎儿。（4）焦测序方法的检出率为85%（34/40）,准确性为100%（34/34）,其中具有杂合型SNP位点样本的检出率及准确性均为100%（34/34）。结论：采用杂合型SNP定量焦测序分析技术诊断DS,检测过程快速、简便、检出率高、准确性好,可应用于DS的临床快速产前诊断。

单核苷酸多态性检测方法的研究进展

单核苷酸多态性(single nuc leotide polymorph ism,SNP)的研究已成为人类后基因组时代的主要内容之一。因此建立高度自动化和高通量的SNP检测分析技术十分重要。文章系统地介绍了最新发展的几种SNP检测技术的原理和检测平台,详细阐述了等位基因特异性杂交、内切酶酶切技术、引物延伸法、寡核苷酸连接反应等SNP检测原理,以及平板读数仪、基因芯片、微球阵列技术和质谱仪等检测平台,并对SNP高通量检测技术的发展进行了展望。

单管高灵敏度等温扩增技术快速检测甲型H1N1流感病毒

建立了单管逆转录环介导等温扩增法(RT-LAMP)快速检测甲型H1N1流感病毒的方法。针对甲型H1N1流感病毒的M基因和HA基因的保守区,设计了两组特异性引物,分别用于筛选甲型流感病毒及鉴定甲型H1N1流感病毒。对反应体系中的关键因素进行优化,反应结果可直接通过浊度或者SYBR GreenⅠ荧光进行判定。本方法最低可检测到10拷贝/管的甲型H1N1流感病毒。为验证方法的可行性,对30例临床样本进行了检测,与美国疾病控制与预防中心(CDC)的TaqMan方法进行对比,检测的灵敏度和特异性分别为92%和100%。本方法实现了单管快速检测甲型H1N1流感病毒,为甲型H1N1流感病毒的现场检测提供了新方法。

MicroRNA定量检测方法的研究进展

MicroRNA是一类内源性的非编码小分子RNA,通过下调蛋白编码基因的表达而对不同的细胞发育过程起到重要的调控作用。分析组织或细胞样本中microRNA的表达可为研究这类分子的生物学功能提供重要的信息。近年来,研究者发展了许多方法检测不同的生理和病理学过程中microRNA的表达差异,并发现microRNA的异常表达与癌症、神经紊乱和心脏疾病等的发生相关。文章系统地介绍了最新发展的microRNA定量检测方法,详细阐述了基于探针杂交技术的Northern blotting法、微阵列芯片法、纳米金标记法、桥连同位素标记法,以及基于扩增技术的定量PCR检测法、滚环扩增法、引物入侵法和新一代大规模高通量测序法等,并对这些方法的优缺点进行了分析比较。

焦测序技术及其在遗传分析中的应用

焦测序技术是一种新的实时DNA测序技术。它在DNA聚合酶、三磷酸腺苷硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶4种酶的协同作用下,使引物延伸聚合脱氧核糖核酸(dNTP)释放焦磷酸盐(PP i)、PP i转换三磷酸腺苷(ATP)、ATP产生荧光信号与dNTP和ATP的降解等化学反应偶联起来,检测结果准确可靠。本文综述了焦测序技术的基本原理、操作步骤和它在单核苷酸多态性(SNP)研究、微生物的分型鉴定和基因甲基化检测等遗传分析中的应用,并对焦测序技术的发展作了展望。

大肠杆菌表达系统的研究进展

近年来利用基因调控、融合表达、共表达以及代谢工程、定向进化等策略对大肠杆菌系统的载体和宿主进行了合理的改进,使目的基因的表达水平以及产物蛋白的活性大大提高,尤其是对长期以来有关真核基因在原核细胞中表达所存在的糖基化、二硫键形成等翻译后加工问题的研究取得了突破,使得大肠杆菌表达系统在研究和生产中的应用范围得到进一步拓宽。文章从表达载体和宿主细胞两个方面对大肠杆菌表达系统的研究进展进行了综述。

热稳定生物素化荧光素酶的制备及其在焦测序中的应用

新一代大规模焦测序技术需要稳定的可固定化的荧光素酶,为了制备热稳定性好且被生物素化的荧光素酶,本研究采用基因工程方法将生物素羧基载体蛋白C端87个氨基酸残基(BCCP87)与荧光素酶在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中进行融合表达,以实现菌体内直接表达生物素化的荧光素酶(BCCP-LUC);并对北美萤火虫(Photinus pyralis)荧光素酶基因进行了定点突变以增强其热稳定性;用链亲和素包被的磁珠对重组融合蛋白进行固定化,用于焦测序。实验结果表明:突变后的荧光素酶在50℃环境中仍具有活性;在43℃下10min活性保留大于80%,热稳定性明显增强。Western blot分析结果表明,荧光素酶能够在大肠杆菌内生物素化。用链亲和素包被的磁珠结合BCCP-LUC后具有较高活性(2.1×105RLU/μL Beads),经过多次洗涤活性无明显下降。采用微球固定的荧光素酶以及ATP硫酸化酶成功的进行了DNA序列的测定且定量准确,表明固定化的荧光素酶可以应用于焦测序中,为建立高通量大规模芯片焦测序技术提供有效、稳定的工具酶。

全血PCR直接扩增技术在亚甲基四氢叶酸还原酶基因C677T多态性分析中的应用

[目的]应用全血PCR直接扩增技术检测准安汉族人群亚甲基四氢叶酸还原酶基因MTHFRC677T多态性并分析其地理分布特征，评价该技术在大规模现场人群基因多态性筛检中的应用价值。[方法]应用全血PCR直接扩增技术分析205例淮安汉族健康个体MTHFRC677T的基因型分布频率，并与传统的聚合酶链反应一限制性片段长度多态性（Polymerase chain reaction and restriction fragment length polymorphism，PCR—RFLP）技术检测结果进行比对。并将检测结果与已报道的不同地区汉族人群资料进行比较。[结果]全血PCR直接扩增技术与传统PCR—RFLP法测定MTHF RC677T多态性的分布频率具有高度一致性（Kappa=0.946，95％CI：0，906～0．985o结果表明淮安汉族人群MTHFRC677T的基因型频率分别为CC32，68％、CT46．83％、TY20.49％；C和T等位基因频率分别为56.10％和43．90％；结合其他9个地区的汉族人群MTHFR677T等位基因频率的趋势性x^2矿检验，发现MTHFR677T的分布随地理纬度的降低，T等位基因频率也降低（P=0．001。[结论]全血PCR直接扩增技术简便易行，适用于人群基因多态性的快速筛检。在所研究的10个中国汉族人群中MTHFRC677T多态性显示与不同地理纬度的地区分布有统计学相关性。

利用线性指数PCR-焦磷酸测序技术快速检测3种海洋弧菌

目的:建立一种基于线性指数聚合酶链式反应(linear-after-the-exponential PCR,LATE-PCR)焦磷酸测序技术快速检测致病性海洋弧菌的方法。方法:首先根据海洋弧菌的16S rRNA基因和外膜蛋白K(OmpK)基因的目的片段设计引物并优化反应条件进行LATE-PCR扩增,其次利用酶促反应处理PCR产物中干扰焦磷酸测序反应的副产物,最后加入退火引物后直接进行焦磷酸测序。结果:成功进行了LATE-PCR扩增,制备出足量单链DNA模板供焦磷酸测序反应;取1~2μL的PCR产物即可获得理想的焦磷酸测序信号。测序结果与Sanger法的结果一致,测得序列与GenBank所报道的相符合。通过对16S rRNA基因片段的检测,可以确认样品是否为海洋弧菌;通过对OmpK基因目的片段的检测可以初步区分弧菌种类,对3种常见弧菌:副溶血弧菌、哈维弧菌和溶藻弧菌成功地进行了检测。结论:本方法结果准确,灵敏度高,操作简便且成本低,可快速检测大量样品,在弧菌快速检测和诊断中具有很好的应用前景。

生物素化ATP硫酸化酶的表达、固定化与应用

现代大规模焦测序技术的产生是DNA测序技术的一次革命,其关键技术之一是得到高活性的、固定于磁性微球表面的ATP硫酸化酶.生物素化的ATP硫酸化酶可以通过生物素与亲和素之间的特异结合特性固定在包被亲和素的磁性微球表面,但是利用化学修饰法将ATP硫酸化酶进行生物素化修饰很可能会影响酶的活性.利用融合表达策略,将大肠杆菌生物素酰基载体蛋白C端87个氨基酸肽段(BCCP87)与ATP硫酸化酶在大肠杆菌内融合表达,经SDS-PAGE和Westernblot分析,表达的融合蛋白分子质量约为64ku,并且能够在大肠杆菌内被生物素化.生物素化的ATP硫酸化酶能够与亲和素包被的磁珠结合,固定后的ATP硫酸化酶具有活性,并且能够用于定量检测焦磷酸盐(PPi)和焦测序,为今后建立高通量大规模焦测序系统提供了一个有效的工具酶.

蚊虫驱避剂的驱避机理研究(英文)

本文就蚊虫驱避机理的研究进行了综述,详细介绍了目前两类主流的驱避机理假说:驱避剂干扰嗅觉系统以阻断蚊虫对宿主气味的识别、驱避剂激活嗅觉神经元引起蚊虫的主动躲避行为。介绍了笔者所在实验室近几年对驱避剂进行的相关研究,以及从驱避剂与引诱剂缔合作用的角度对驱避机理的研究。

高灵敏度焦磷酸测序平台的建立及应用研究

焦测序技术是一种基于生物发光法测定焦磷酸盐的测序技术,在进行DNA序列分析时不需要电泳和荧光标记,定量性能好,结果准确,可实现自动化。但其应用过程中存在3个技术瓶颈:一是测序试剂灵敏度低、成本高;二是测定仪器价格昂贵;三是测序模板制备过程繁琐。本课题组针对这些技术瓶颈,提出了一整套解决方案,包括高灵敏度焦测序反应试剂的研制、小型便携式焦测序仪的研制、测序模板的制备方法研究等。建立的高灵敏度微型化焦测序平台在分子诊断的各个领域得到了充分的应用,如细菌病毒转基因成分等的序列测定、单核苷酸多态性测定、拷贝数变异测定、基因突变位点测定、microRNA测定、基因表达量测定和药物基因组学研究,具有测序灵敏度高、仪器体积小、成本低、操作简便快速等优点,应用前景广阔。本文详细介绍了本课题组在提高焦磷酸测序反应灵敏度、简化测序过程、改进测序仪器和拓展焦磷酸测序应用范畴所做的系列创新性工作。

三种核酸共提取试剂盒对血液病毒提取效能的比较研究

目的比较不同核酸共提取试剂盒对血液病毒的提取效能差异。方法选择国内外广泛使用的3种血液病毒核酸共提取试剂盒,分别为OMEGA试剂盒、QIAGEN试剂盒和WATSON试剂盒,HBV阳性、HBV阴性、HCV阳性和HCV阴性血清样本均取自南京军区南京总医院。样本核酸提取按照各试剂盒说明书进行操作,定量方法采用实时荧光定量PCR。结果 OMEGA试剂盒对DNA的提取效率最高,对RNA的提取效率最低,耗时最短,成本居中;QIAGEN试剂盒DNA和RNA提取效率均较高,耗时居中,成本最高;国产WATSON试剂盒对DNA或RNA提取效率居中,耗时最长,成本最低。结论不同试剂盒对血液病毒的提取效能各不相同。对于已知病毒载量和病毒种类的样本,根据提取液DNA浓度和RNA浓度选择试剂盒;而对于未知病毒载量和病毒种类的样本,首选QIAGEN试剂盒,其次可选WATSON试剂盒。如只考虑成本,则首选WATSON试剂盒。

微量空斑减数试验测定干扰素活性的实验研究

作者建立了一种简便、快速的微量 VSV病毒空斑实验方法,并用该方法测定干扰素活性,结果表明,该方法敏感、快速,重复性好,可测定到0.5活性单位的干扰素,在36～48h可以完成。

Trop2对胃癌细胞耐药性的影响及机制研究

目的:探讨滋养层细胞表面抗原2(Trop2)对胃癌细胞化疗耐药的影响及机制。方法:应用慢病毒转染技术将Trop2 sh RNA转染至BGC823细胞株,通过嘌呤霉素筛选出稳定转染质粒的细胞株;q RT-PCR、Western blot和免疫荧光方法检测质粒干扰效率;CCK-8细胞增殖试验和流式细胞术检测柔红霉素对BGC823细胞株增殖能力和细胞凋亡的影响;q RT-PCR、Western blot检测耐药相关基因TopoⅡα的m RNA和蛋白表达变化。结果:在稳定转染Trop2 sh RNA质粒的sh Trop2组中,Trop2 m RNA及蛋白表达水平较对照组(未处理)和sh NC组(转染空载体质粒)明显下调;在相同药物浓度下,柔红霉素对shTrop2组的增殖抑制率明显高于对照组和sh NC组,sh Trop2组半数抑制浓度低于对照组和sh NC组(P<0.05),sh Trop2组中柔红霉素诱导的细胞凋亡率显著高于对照组和sh NC组(P<0.05);稳定干扰Trop2表达后耐药相关基因TopoⅡα的表达显著上调。结论:Trop2通过抑制TopoⅡα的表达,可增强胃癌细胞对柔红霉素的耐药性。

利用孕妇血浆中胎儿DNA进行无创性产前诊断的研究进展

产前诊断对于预防及控制新生儿发病率具有十分重要的意义。目前,大多数的产前诊断方法对孕妇和胎儿具有潜在的损伤,所以临床医生一直在寻找新的无创性产前诊断技术。研究表明胎儿细胞存在于孕妇外周血中,但由于其数量较少,而且存在个体差异,因此很难应用于临床。最近的研究发现母体血浆或血清中存在高浓度的游离胎儿DNA。近年来,随着分子生物学技术的发展,从孕妇血浆或血清中检测胎儿DNA并应用于临床成为可能,为无创性产前诊断开辟了一种新途径。本文着重介绍游离胎儿DNA的来源、特点及在无创性产前诊断中的应用。

一种无染料基于序列标签结合焦测序解码的多基因表达量同时测定技术及在大肠癌诊断中的应用

随着人类基因组计划的深入，从基因组微观分子水平研究疾病已经日趋成熟。在基因组的构造解析己完成的基础上进一步对基因功能进行解析，即mRNA及翻译产物蛋白质的情况，也是现今的研究重点之一。目前认为多数疾病都存在着基因表达的变化，如癌症的发生和发展的过程中伴随着基因表达的异常，因此基因表达量的分析能提高治疗的质量及病人的存活率，己逐渐成为基因分析的主要课题。

噬菌体展示筛选修饰nNOS活性多肽的研究

多种疾病的病理过程涉及脑型一氧化氮合酶(nNOS)的活性改变。为了寻找特异的nNOS调控分子,将nNOS的钙调素结合区以大肠杆菌(E.coli)表达,表达蛋白经纯化后作为靶分子用于12肽噬菌体展示库筛选。得到10个对nNOS具有特异性抑制作用的克隆,DNA测序显示一个氨基酸共同序列:KPHHHPMPPQVS,将其命名为NPI。合成的NPI多肽对从小鼠脑新鲜制备的nNOS具有抑制作用(抑制率为25%～35%),而对失去部分活性的nNOS却表现为剂量依赖的恢复活性效应。结果提出一种研发nNOS调节药物的新方法—噬菌体展示技术,同时NPI对nNOS活性的双向调节功能也为认识机体自身nNOS活性的调控过程提供新的启示。