气相色谱-质谱联用选择离子监测方法定量分析低浓度胞内游离氨基酸的^(13)C同位素丰度

胞内游离氨基酸具有周转快的特点,其13C同位素丰度能快速反映胞内代谢状态的变化。但胞内游离氨基酸的浓度很低,现有的基于气相色谱-质谱联用全扫描模式的13C同位素丰度检测方法不能满足要求。本研究考察理论上检测精度更高的选择离子监测方法在胞内游离氨基酸13C同位素丰度分析中应用的可能性。首先在全扫描模式下分析了不同氨基酸的断裂规律,找出与每种氨基酸对应的特征碎片,建立起包含有16种胞内游离氨基酸的特征碎片库。利用此特征碎片库,在样品分析时只需检测特定m/z处的信号,从而实现选择离子监测,提高信号质量。对标准品的检测结果表明,与全扫描模式相比,本方法的信噪比、测量精度和准确性分别提高了17倍、2倍和3.8倍。在对辅酶Q10生产菌株样品的分析中,本方法成功检测出8种胞内游离氨基酸的同位素丰度。

温度诱导模式对重组大肠杆菌质粒拷贝数的影响

对于大肠杆菌温度表达系统,温度的选择和变化对外源基因的表达至关重要,最直接的因素表现在对质粒拷贝数的影响上。本文通过重组大肠杆菌DH 5α表达载脂蛋白A I-M ilano来分析不同温度诱导模式对质粒拷贝数的影响,确立了二次升温诱导(30°C→42°C→37°C→42°C)有利于菌体质粒拷贝数的增加,从而提高目的蛋白的表达量,结果表明:二次升温诱导比一次升温诱导蛋白表达量增加80%。

产黄青霉形态的显微图像分析研究

利用显微图像分析法对产黄青霉的菌丝形态进行了定量研究 ,并统计分析了青霉素发酵过程中菌丝形态的变化规律 ,具体对菌丝总长度、菌丝生长期的菌丝生长单位。

红外光谱-人工神经元网络法测定海藻培养过程中的碳酸盐浓度

用傅里叶变换红外光谱法测定海藻培养液中碳酸盐浓度时,由于pH对碳酸盐特征吸收峰影响严重,本文用人工神经元网络处理红外光谱,用该方法计算得到对标准样品的预测标准误差为NaHCO30.08g/L,pH值为0.12,优于偏最小二乘法的结果。用该方法对实际螺旋藻培养过程中的碳源浓度进行了测定,预测标准误差为0.65g/L。

^(13)C辅助的超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用方法精确分析毕赤酵母胞内代谢物浓度

毕赤酵母作为一种高效的外源蛋白表达平台,其蛋白表达水平与胞内代谢物浓度紧密相关。但胞内代谢物种类多、物化性质差异大、浓度低、周转快,对其绝对浓度的精确检测一直难于实现。本研究将超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用分析方法与13C同位素标记技术相结合,探索解决该难题的方法。首先,优化了超高效液相色谱的操作条件,利用3种色谱柱实现了64种常见中间代谢物的分离;对三重四极杆质谱仪的检测离子对和碰撞电压等操作条件进行优化,找到了对各种物质具有专一性的检测离子对。然后,利用全标记13C标记底物培养细胞,收集胞内的全标记代谢物用作定量内标物,建立了53种中间代谢物的标准曲线。实验结果表明,本方法不但精确性高,标准曲线相关系数达到0.99以上,而且重现性好,受实验条件和仪器操作条件的影响很小。将本方法应用于毕赤酵母胞内代谢物浓度的绝对定量分析,成功获得了胞内各种代谢物的浓度水平,为后续深入研究毕赤酵母代谢调控机理,实现外源蛋白的高效生产奠定了基础。

大黄鱼凝血酶原类似基因的克隆及其表达分析

采用快速末端cDNA扩增法，首次从大黄鱼中克隆到全长为2023bp的凝血酶原类似基因cDNA，编码为617个氨基酸，其中包括80bp的5’末端非编码区及89bp包含poly（A）尾的3’末端非编码区。预测1～15位的氨基酸处存在1个信号肽。推导的氨基酸序列与哺乳动物及其他鱼类进行同源性比较，发现其与红鳍东方纯有73％同源性，而与哺乳动物的同源性为50％～65％。凝血酶原类似基因虽然在大黄鱼的各个组织中组成型表达，但是在减毒鳗弧菌免疫的大黄鱼的脾脏和肾脏中表达明显上调，这表明凝血酶可能参与大黄鱼对细菌侵染的免疫应答。