发酵过程多水平问题及其生物反应器装置技术研究——基于过程参数相关的发酵过程优化与放大技术

回顾了发酵过程优化与放大所依据的基本思想和方法 ,认为采用以动力学为基础的最佳工艺控制点为依据的静态操作方法 ,实质上只是化学工程宏观动力学概念在发酵工程上的延伸 ,往往忽视细胞代谢流的存在。以细胞代谢流的分析与控制为核心的生物反应工程学的观点 ,通过实验研究 ,提出了基于参数相关的发酵过程多水平问题研究的优化技术和发酵过程多参数调整的放大技术。随着过程传感技术和计算机技术的发展 ,设计了一种定型为FUS 5 0L (A)的新概念生物反应器。这种新型生物反应器是以物料流检测为手段 ,过程优化与放大为目标 ,成功地应用在青霉素、红霉素、金霉素、肌苷、鸟苷发酵和Pichia酵母表达系统的基因工程人血清白蛋白 (rh SA)、疟疾疫苗等高密度高表达培养 ,大幅度提高发酵水平 ,并直接放大到几百升 ,甚至 10 0m3

发酵工程研究与技术进步

发酵工程是利用微生物进行大规模生产的工程技术，属于微生物学与工程学相结合的以产品生产为导向的一门应用技术领域。因此，如果要深入研究发酵过程原理实现发酵工程优化与放大，必须有深入的生物学和工程学研究基础。重点阐述发酵工程的基础理论研究及其技术进步，并探讨其对产业应用的重大影响。

必特螺旋霉素基因工程菌发酵参数的研究

曾利用同源重组技术构建了稳定的必特螺旋霉素基因工程菌。本研究在30L全自动发酵罐从菌体生长,糖、氮源利用及发酵效价增长情况考察了必特螺旋霉素基因工程菌的发酵过程,研究了发酵过程摄氧率(OUR)、二氧化碳释放率(CER)、溶解氧(DO)等在线参数的变化,着重研究了不同溶氧水平对必特螺旋霉素发酵的影响。结果表明溶氧水平尤其是发酵前期溶氧水平对必特螺旋霉素发酵影响至关重要,前期临界氧浓度应控制在25%左右。本研究为必特螺旋霉素发酵放大工艺研究提供了依据。

利用中心组合设计方法研究维生素对乳酸生产的影响

顺序采用两水平分式析因设计、最速上升法以及中心组合响应曲面方法研究了维生素B1、维生素B2、烟酸、盐酸吡哆醛和生物素对拟干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)合成乳酸的影响,并利用数据分析软件(Statistical Analysis System,SAS)对数据进行处理。结果表明,维生素B1和生物素对L.paracasei的生长及产酸有比较显著的促进作用,维生素的最佳组合是:维生素B10.053mg/L、维生素B20.01mg/L、烟酸4.0mg/L、盐酸吡哆醛0.2mg/L、生物素0.075mg/L。

中心复合实验设计法优化重组毕赤酵母表达猪胰岛素前体的培养基和诱导pH

毕赤酵母中猪胰岛素前体(Porcine Insulin Precursor,PIP)的表达受到培养基组成及培养环境的影响。本文首先通过部分因子法设计实验,筛选出影响PIP表达的显著因子。实验结果表明,在试验范围内,甲醇补料量和硫酸铵浓度为正效应因子,诱导pH为负效应因子。在此基础上,经过快速登高法逼近显著因子的最优值后,再在此值附近利用中心复合法设计实验,最终得到了PIP表达的最佳条件。经过多批次实验验证,在此条件下PIP的表达量为120.4mg/L,比优化前的值41.5mg/L提高了将近两倍。

芽胞杆菌生产嘌呤核苷研究进展

嘌呤核苷在食品和医药领域都有广泛的应用。应用芽胞杆菌生产嘌呤核苷类物质的研究始于 6 0年代 ,其后对合成途径及其代谢调控机制相继进行了深入的研究 ,以下就此做详尽的综述 ,并以肌苷、鸟苷为例 ,对利用芽胞杆菌发酵生产嘌呤核苷的菌种选育和工艺调控的进展做全面的回顾。

中心组合设计优化必特螺旋霉素合成培养基

将克隆自卡波霉素产生菌的4"-O-异戊酰基转移酶基因整合到螺旋霉素产生菌S trep tomy ces sp iramy ceticus F-21的染色体上,构建成一株稳定的生物工程菌W SJ-1-195,它产生的一组以4"-O-异戊酰螺旋霉素为主要成分的多组分基因工程新型抗生素命名为必特螺旋霉素。针对目前没有适合必特螺旋霉素产生菌的合成培养基,所以本文顺序通过部分因子析因设计法、最速上升实验、中心组合实验,并利用统计学软件SA S V 8对实验数据进行分析,确定了必特螺旋霉素合成培养基的组成,为以后对必特螺旋霉素生理生化特性的研究提供基础。经过优化后必特螺旋霉素的发酵效价从173μg/m l提高到1880μg/m l。

鸟苷发酵过程的多尺度问题研究

以鸟苷发酵为对象 ,在生物反应器中以多尺度问题的角度 ,对在线计算机数据进行相关分析 ,结合中间代谢物及有关酶活性的检测 ,建立了以代谢流为核心的多尺度调控方法 ;又通过与代谢流迁移有关的动态化学计量分析 ,实现了对批式发酵过程的时变系统估算 ,建立了主体代谢与产物形成的支路代谢间 ,包括能量与物质流的关系模型 ;最后 ,把具有不同生产能力菌株的关键基因与基因库数据进行了序列比较 ,发现了本文研究的菌株已具备高产能力 ,即编码sAMP合成酶的基因发生移码突变以及pur操纵子的多处突变 ,而中心代谢流迁移是过程优化的关键。对开展微生物功能基因组学的研究和工业过程优化的问题进行了探讨 ,作者提出有必要从生物反应器的系统生物学高度来认识和解决所面临的问题。

毕赤酵母高密度表达重组猪胰岛素前体的研究

对摇瓶和50L罐上的重组菌毕赤酵母(Pichia pastoris)表达猪胰岛素前体(PIP)的发酵过程进行了研究。摇瓶发酵中,最佳诱导周期为60 h左右,诱导期甲醇的最佳加入量为每日2．0%～2．5%。50L发酵过程分为批发酵、补料和诱导表达3个阶段。生长期(批发酵和补料阶段)细胞干重与培养时间的关系可用模型y= 0．6525e^(0．1909t)来描述。在批发酵阶段和补料阶段,流加的氨水和甘油几乎全部用来合成菌体和维持,没有其他副产物产生。诱导表达阶段流加的氨水和甲醇分别约有80%和70%被菌体利用。将摇瓶与发酵罐的实验结果进行了比较,发现摇瓶发酵的限制因子很可能是溶氧,而罐发酵的限制因子为碳源,因此,将摇瓶实验的结果放大到发酵罐时调整了控制策略,加大了甲醇的补料速率,最终PIP浓度达到1．72g/L。

两次诱导实现重组大肠杆菌高密度、高表达研究

通过不同温度诱导模式对大肠杆菌高密度,高表达的研究,确定两次升温诱导模式实现大肠杆菌高密度、高表达重组人载脂蛋白的目的。实验证实两次诱导成功的避免了乙酸对高密度、高表达的影响,最终发酵的细胞密度OD600达150,蛋白表达量4.8g·L-1,证明两次升温诱导的发酵方法在高密度、高表达外源蛋白上是成功的,从而为基因工程菌规模化生产奠定了基础。

搅拌对顶头孢霉丝形态和头孢菌素C生物合成的影响

搅拌能充分混合物料,增强氧的传递,但搅拌强度过强会影响工业生产菌的菌丝形态和产物生成。在头孢菌素C的发酵生产过程中,菌丝形态与产素的关系密切,通过采用显微图像定量分析技术,计算菌丝总长度和菌丝平均生长单位,表明过高的搅拌速度会打断菌丝,造成机械损伤,明显降低产率。更换80m3生产罐搅拌桨之后,降低了剪切作用,大罐的发酵效价提高了33.3%,达到22926.8μg/m l。

甘油对利福霉素SV生物合成的影响

利福霉素SV脂肪链桥部分的合成是以乙酸单位(由丙二酰CoA提供)和丙酸单位(由甲基丙二酰CoA提供)为延伸单元经过缩合、环化和后修饰而形成的,一些短链碳前体对二碳或三碳延伸单位的合成具有调节作用。研究发现添加一定量的甘油对利福霉素SV的生成具有明显的促进作用,其最适添加量为3%,添加时间以72h为宜,并且分批补加效果更好,最高提高效价21%以上。有机酸分析结果显示,甘油的加入导致乙酸和琥珀酸在胞外积累的增加,促进了EMP和TCA代谢途径,有利于利福霉素SV合成前体的积累。

重组人血清白蛋白发酵过程表达期的定量研究

结合元素平衡和代谢平衡 ,建立了重组人血清白蛋白发酵过程表达期的数学模型 ,按单纯形多变量最优化方法估算了模型的未知参数 ,并探讨了导致表达期不同阶段产物形成速率存在差异的可能原因。该模型能较好地描述重组人血清白蛋白发酵过程表达期中各宏观反应速率之间的关系 ,为重组人血清白蛋白的高效表达提供了线索。

金色链霉菌培养条件优化研究

金色链霉菌摇瓶培养适宜的接种量为3.2%、接种时间为25h、温度在28°C左右。4g/L的硫酸铵和0.043g/L无机磷有利于产物金霉素(CTC)合成。酵母膏的加入对CTC的合成有一定促进作用,以3g/L的效果较好。在50L发酵罐中,较低浓度的无机磷对CTC发酵有利;酵母膏的加入量以4.2g/L最佳,产物效价比酵母膏加入量为2.8g/L和5.6g/L时高3.1%和9.7%,优化发酵过程的CTC产率提高了18%。

南昌链霉菌生物合成梅岭霉素种子制备优化

以参数相关理论为指导,优化南昌链霉菌生物合成梅岭霉素种子制备工艺。结果表明,培养20～35h后,pH7.30～7.50,总糖<0.35%,pmv>10%,溶磷<100μg/ml,菌丝分化启动有利于提高梅岭霉素的发酵效价。

红谷霉素生料发酵工艺的研究

红谷霉素是链霉菌702发酵所产的一种生物活性物质,具有较强抗细菌活性。在摇瓶条件下,对链霉菌702生料发酵生产红谷霉素进行研究,采用单因素实验探索生料发酵工艺,筛选出摇瓶生料发酵条件为7.5%的种子接种量和添加抗菌剂1.5ml。在此条件下进行生料发酵,使红谷霉素摇瓶发酵产量达到1.46g/L,比常规灭菌发酵产量提高25.7%,实验结果表明红谷霉素生料发酵是一种潜在可行的发酵方法,不但可以很好地节约发酵成本,还可以提高发酵产量。

添加异戊酸对必特螺旋霉素生物合成的影响

为了进一步提高多组分必特螺旋霉素中异戊酰螺旋霉素Ⅲ和总异戊酰螺旋霉素的含量,本文通过外源添加浓度为0.5 g/L的异戊酸使异戊酰螺旋霉素Ⅲ和总异戊酰螺旋霉素的含量分别比对照提高了38.32%和31%。通过测定必特螺旋霉素发酵过程中糖耗、有机酸、亮氨酸脱氢酶、琥珀酸脱氢酶、己糖激酶等中间代谢产物的相关数据,探讨了异戊酸调控必特螺旋霉素组分和效价的机理。

红谷霉素对细菌抑制效果研究

红谷霉素是链霉菌702发酵后所产的一种生物活性物质,具有较强抗细菌活性。研究表明,红谷霉素对大肠杆菌的最低抑菌浓度为40mg/L,对枯草芽胞杆菌的最低抑菌浓度为0.08mg/L。红谷霉素在微生物生长迟滞期添加比在其它生长阶段添加抑菌效果更好,红谷霉素对热和紫外线比较稳定。通过与其他防腐剂的抑菌效果比较表明,红谷霉素对细菌的抑菌效果优于比较的防腐剂。

利用具有pH检测控制和补料功能的新型摇床研究利福霉素SV种子培养

本文利用具有pH检测控制与补料功能的新型摇床,得到了利福霉素SV种子的最适接种量范围为6%～8%(V/V)及最适移种时间为对数生长期末期(判断标准为pH到达第二个低谷),并建立了预测菌体浓度的数学模型。检验证明此模型能够较准确地预测利福霉素SV产生菌在对数生长期及移种时(对数生长期末期)的菌浓,并可用于预测在一定接种量下达到预定菌浓所需的培养时间。本模型在适宜的接种量范围内准确度较高,但随接种量的偏离程度的增加准确度有所减小;另外本模型只在培养基成份、培养环境等条件不变时适用,否则模型参数需重新估计。

不同猪胰岛素前体基因拷贝数Mut^+型毕赤酵母的摇瓶发酵研究

毕赤酵母是优秀的外源蛋白的表达系统之一。本文对Mut^+型的不同PIP基因拷贝数的毕赤酵母进行了摇瓶试验。研究了生长特性以及对外源蛋白表达量的影响等。发现了低拷贝和高拷贝的蛋白表达量、生长情况有差异。G12重组菌的PIP表达量最高为181.6mg/L,是单拷贝重组菌表达量的12.6倍。对于基因拷贝数低于12的菌株,PIP表达水平与PIP基因拷贝数成线性关系(r=0.996)。