抗生素发酵过程优化技术研究

本文以抗生素发酵的工业生产为目标 ,讨论发酵过程优化技术进展。认为当前存在的主要问题是缺乏以细胞代谢流为核心的过程分析 ,采用动力学为基础的最佳工艺控制点为依据的静态操作方法实质上只是化学工程动力学概念在发酵工程上的简单延伸。文章在研究反应器物料流与微生物细胞代谢流的相关特性后 ,提出了基于参数相关的发酵过程多水平问题研究的优化技术 ,先后成功地应用在青霉素、红霉素、金霉素、链霉素等发酵产品中。又进一步对抗生素作为次级代谢产物的参数相关特性进行研究 ,认为由遗传因素决定的生物大分子合成体系的代谢特性与参数变化的松散相关或基因水平的启动相关 ,造成以抗生素生产为目标的趋势曲线相关分析的困难。文章讨论了优化控制理论在抗生素发酵过程优化中的应用 ,认为发酵过程初期出现的混沌现象 ,应从细胞生物学角度找原因 ,从宏观到微观 ,由细胞生长代谢到基因表型特性 。

大数据时代的生物过程研究

在讨论实现生物技术产业化时,认为由于从基因、细胞到生物反应器操作的生物过程高度复杂性,必须改变传统的数据处理思维方式。建议采用大数据分析方法和工业4.0,打破生命科学上游研究到生物制造下游研究的多学科技术壁垒,其大数据分析的4V特征和3个观念转变是生物过程研究的基本出发点。总结了笔者研究组近几十年的研究成果,分析了发酵过程多尺度理论方法与大数据分析理念,由此探索形成新的概念、理论、方法与装备技术。其中最重要的技术进展标志是生物反应器由原来的参数自动控制演变为实现过程优化与放大决策的智能控制,以及＂数据超载＂情况下的＂信息→相关→因果→知识＂的研究过程。

鸟苷发酵过程的多尺度问题研究

以鸟苷发酵为对象 ,在生物反应器中以多尺度问题的角度 ,对在线计算机数据进行相关分析 ,结合中间代谢物及有关酶活性的检测 ,建立了以代谢流为核心的多尺度调控方法 ;又通过与代谢流迁移有关的动态化学计量分析 ,实现了对批式发酵过程的时变系统估算 ,建立了主体代谢与产物形成的支路代谢间 ,包括能量与物质流的关系模型 ;最后 ,把具有不同生产能力菌株的关键基因与基因库数据进行了序列比较 ,发现了本文研究的菌株已具备高产能力 ,即编码sAMP合成酶的基因发生移码突变以及pur操纵子的多处突变 ,而中心代谢流迁移是过程优化的关键。对开展微生物功能基因组学的研究和工业过程优化的问题进行了探讨 ,作者提出有必要从生物反应器的系统生物学高度来认识和解决所面临的问题。

毕赤酵母高密度表达重组猪胰岛素前体的研究

对摇瓶和50L罐上的重组菌毕赤酵母(Pichia pastoris)表达猪胰岛素前体(PIP)的发酵过程进行了研究。摇瓶发酵中,最佳诱导周期为60 h左右,诱导期甲醇的最佳加入量为每日2．0%～2．5%。50L发酵过程分为批发酵、补料和诱导表达3个阶段。生长期(批发酵和补料阶段)细胞干重与培养时间的关系可用模型y= 0．6525e^(0．1909t)来描述。在批发酵阶段和补料阶段,流加的氨水和甘油几乎全部用来合成菌体和维持,没有其他副产物产生。诱导表达阶段流加的氨水和甲醇分别约有80%和70%被菌体利用。将摇瓶与发酵罐的实验结果进行了比较,发现摇瓶发酵的限制因子很可能是溶氧,而罐发酵的限制因子为碳源,因此,将摇瓶实验的结果放大到发酵罐时调整了控制策略,加大了甲醇的补料速率,最终PIP浓度达到1．72g/L。

添加异戊酸对必特螺旋霉素生物合成的影响

为了进一步提高多组分必特螺旋霉素中异戊酰螺旋霉素Ⅲ和总异戊酰螺旋霉素的含量,本文通过外源添加浓度为0.5 g/L的异戊酸使异戊酰螺旋霉素Ⅲ和总异戊酰螺旋霉素的含量分别比对照提高了38.32%和31%。通过测定必特螺旋霉素发酵过程中糖耗、有机酸、亮氨酸脱氢酶、琥珀酸脱氢酶、己糖激酶等中间代谢产物的相关数据,探讨了异戊酸调控必特螺旋霉素组分和效价的机理。

龟裂链霉菌工业菌中zwf1基因的阻断对土霉素生物合成影响

目的运用代谢工程手段对龟裂链霉菌工业菌(Industrial Streptomyces rimosus,SRI)进行基因改造,提高土霉素(oxytetracycline,OTC)产量。方法利用pKC1139质粒阻断SRI基因组中葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase)编码基因zwf1。结果筛选得到一株OTC高产突变株,将突变株与原始菌株进行发酵,发现OTC产量比原始菌株提高了36.2%。结论 SRI基因组中zwf1基因的缺失使细胞合成土霉素的能力增强;龟裂链霉菌中初级代谢关键基因调控会影响次级代谢。

利用均匀实验优化利福霉素SV发酵培养基氮源配比

应用均匀设计的方法对利福霉素SV发酵培养基中的氮源配比进行优化。研究了氮源中各成分对发酵效价的影响,确定各成分的最佳配比并用实验验证,使摇瓶发酵效价提高了10%以上,并对利福霉素SV产生菌在新、老培养基中的代谢特性进行了比较。

Mn^(2+)对必特螺旋霉素产生菌代谢和必特螺旋霉素合成的影响

通过在必特螺旋霉素产生菌WSJ 1 195发酵过程中添加金属离子Mn2 + 发现 :发酵前期 (2 4h左右 )添加Mn2 + 可以明显提高生物效价 ,加入的Mn2 + 浓度以 5mmol L为最佳。实验显示添加Mn2 + 后发酵液pH逐渐下降 ,整个产素期间pH一直低于对照 ;与对照相比添加Mn2 + 摇瓶菌体浓度也较低。通过研究必特螺旋霉素发酵过程有机酸的变化趋势发现 :2 4h添加 5mmol LMn2 + 后发酵过程中有机酸含量已经发生变化 ,其中丙酸浓度的增长最为显著 ,84h时其浓度为对照的 6倍。通过丙酸盐的添加实验证实了发酵前期添加Mn2 + 可以促进产物合成的原因之一是促进了丙酸等前体酸的合成 。

维生素对乳酸菌细胞活性和代谢途径相关酶活性的影响

研究了拟干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)发酵生产乳酸过程中,添加维生素对菌体生长、细胞活性、产酸,以及在碳流代谢中与乳酸生物合成密切相关的4种酶[乳酸脱氢酶(LDH)、磷酸果糖激酶(PFK)、丙酮酸脱氢酶(PDC)和丙酮酸羧化酶(PC)]活性的影响。结果显示:维生素添加促进了菌体生长,使乳酸产量提高了42.47%;同时降低了发酵过程中菌体的死亡率,降低的最大幅度可达53.46%;PFK和LDH的活性比对照有提高,最大幅度达62.30%和126.65%,PDC的活性在发酵中期也有一定的提高,但PC的活性变化很小。实验结果表明:组合维生素的添加可以提高乳酸菌的活性,同时使代谢通量有利于乳酸生成。

基于氧碳平衡的重组巴氏毕赤酵母碳源代谢分析

基于氧元素和碳元素平衡对重组巴氏毕赤酵母 (Pichiapastoris)的不同碳源代谢进行了分析 .结果表明 :以甘油为惟一碳源 ,当比生长速率由 0 0 6 4h-1增大到 0 2 5 7h-1时 ,用于细胞生长的甘油代谢比速率由1 36mmol·g-1·h-1增大到 5 4 6mmol·g-1·h-1,而用于细胞维持代谢流比例降低了 10 4 % ,同时甘油用于合成代谢和分解代谢的比速率均增大 ,但是分解代谢流比例逐渐下降 ,而合成代谢流比例却升高了 5 9% ;以甲醇为碳源进行表达重组人血清白蛋白恒化培养时 ,当比生长速率由 0 0 19h-1增大至 0 0 4 6h-1时 ,用于产物重组人血清白蛋白形成的比速率呈先增大后减少的趋势 ,在比生长速率为 0 0 2 7h-1时最大 ,为 0 31mmol·g-1·h-1,占甲醇总代谢流的 13 2 % .

毒三素链霉菌生产利普司他汀的发酵与提取工艺

研究了以豆油为主要碳源和能源的培养基中毒三素链霉菌的发酵代谢特性。在考察了乳化剂、温度等因素对利普司他汀生产的影响后,发现前期降低温度有利于保持菌种后期生产能力。最终变温发酵利普司他汀的产量达1.32g/L,比28℃恒温发酵提高了62%。并使用丙酮萃取与超声破碎细胞、乙酸乙酯萃取利普司他汀的提取工艺,简化了匀浆过程,提取效率为甲醇提取的3倍。

氨基酸对芽孢杆菌ATCC21616产腺苷的影响

研究了腺苷合成途径中不同前体氨基酸对芽孢杆菌ATCC21616产腺苷的影响。其中谷氨酸对腺苷合成的促进作用最大,能提高产苷30%以上。谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸也能促进腺苷合成,分别提高16%,14%,10%和6%。进一步研究添加谷氨酸后发酵液中NH4+浓度、有机酸浓度和胞内NAD+浓度的变化,发现添加谷氨酸能提供稳定的NH4+供应,并提供重要的代谢中间物α-酮戊二酸。同时,发酵液中乙酸和丙酮酸的浓度比对照低,胞内NAD+浓度较高,糖酵解生成的丙酮酸能顺利地进入TCA循环,从而能为菌体和腺苷合成提供充足的能量和前体,促进腺苷的合成。

梅岭霉素发酵过程参数相关分析和优化

对新型微生物农药梅岭霉素的发酵过程进行研究。通过对发酵过程表征细胞代谢和工程特性的特征参数:氧消耗速率、二氧化碳生成速率、呼吸商、氧传递系数等进行实时在线检测,并利用参数相关分析的方法,对原有工艺不断调整,实现了梅岭霉素发酵过程的初步优化,使发酵效价从原来的150u/ml提高到520u/ml。

多杀菌素种子培养基及发酵培养基的优化

目的以刺糖多孢菌CB11为试验菌株,以发酵培养基菌体浓度和多杀菌素产量为指标,通过单因素实验和正交试验对多杀菌素发酵的种子培养基的碳氮源成分进行优化,在此基础上通过响应面分析试验优化发酵培养基,找出最显著因素并确定其最佳值。方法种子培养基碳氮源成分单因素实验和正交试验,发酵培养基响应面试验。结果得到最优种子培养基配方为:葡萄糖10g/L,甘油5g/L,TSB25g/L,玉米浆10g/L,棉籽蛋白25g/L。在此培养基上生长的种子接入发酵培养基中所获得的多杀菌素产量达到411.26mg/L,较优化前水平(220.30mg/L)提高了86.68%。在此基础上,通过响应面分析试验优化了发酵培养基,得到对多杀菌素生产影响最显著的三个因素及最佳含量分别为葡萄糖66.6g/L、玉米浆14.6g/L、K2HPO42.5g/L,经验证获得的多杀菌素产量为544.60 g/L,较优化前产量提高了24.48%。结论通过对多杀菌素发酵摇瓶种子培养基及发酵培养基的优化,找出了影响多杀菌素发酵的最显著因子及其最适含量,利用优化后的培养基发酵多杀菌素产量提高了86.68%,取得了较好的效果。

盐霉素自身抗性高产突变菌株筛选

目的筛选出具有自身次级代谢产物盐霉素(salinomycin)抗性并且遗传稳定性好的菌株,提高摇瓶效价。方法采用常规化学试剂甲基磺酸乙酯诱变处理盐霉素生产菌株Streptomyces albus S-13孢子,通过系列salinomycin浓度梯度平板进行筛选。结果获得了比生产对照菌株高38%的突变株S-E-6。传代实验表明:S-E-6具有较好的遗传稳定性。同时,通过对盐霉素梯度筛选突变株的单菌落直径与效价进行了统计分析,结果表明突变株菌落直径与盐霉素效价具有正相关特性,线性相关系数(R2)为0.95。

不同拷贝数及间隔肽序列对毕赤酵母分泌表达EXA的影响

通过多拷贝串联表达，以及在分泌信号序列和目的蛋白N端之间插入几个氨基酸的间隔短肽，以提高exendin-4类似物串联体EXA在重组毕赤酵母中的分泌表达水平。实验结果表明：2～5个EXA串联插入均比单个EXA插入有利于提高表达水平，而4拷贝EXA串联体的表达产物较多滞留在胞内。在EXA的N端增加间隔肽可促进蛋白分泌，与不合间隔肽序列的4拷贝EXA串联表达载体相比，含有糖基化住点（NTTEEGEPK）和肠激酶识别位点（DDDDK）间隔肽的插入，使蛋白表达水平分别提高了4倍和9倍。

三孢布拉霉菌发酵番茄红素提取工艺的优化

番茄红素作为一种类胡萝卜素,具有提高免疫力、延缓衰老等多种功能。利用发酵法生产番茄红素是满足市场需求的重要途径。为了更好地提升番茄红素的提取收率,降低发酵过程中各种杂质的含量。研究了不同的溶媒及处理方法对湿菌体进行直接高效萃取的新方法。将番茄红素发酵液经过抽滤、洗涤处理得到湿菌丝体,采用有机溶剂和超声波破碎结合的处理方法,考察了菌丝体状态、皂化条件、脱水剂、提取溶剂、菌丝量与提取溶剂的料液比例、提取时间和提取温度对番茄红素提取率的影响。实验结果表明,利用湿菌体直接提取番茄红素的方法是可行的,并确定了湿菌体直接提取的最优条件:用0.6mol/L NaOH溶液皂化,乙醇脱水处理10min,乙酸乙酯作为提取剂,菌丝体质量(g)与提取溶剂体积(mL)之比为1∶75,在45℃超声处理20min,可获得最高的番茄红素提取率。

阻沫回收分离器在阿维菌素发酵中的应用

目的研究一种新型阻沫回收分离器在农用抗生素阿维菌素工业发酵生产中的应用。方法阿维菌素发酵过程中，应用一种基于泡沫旋风分离与发酵尾气再回收相结合原理的新型阻沫回收分离器。结果放罐系数由原来月平均的65％提高至80％左右，体积增加率为22．47％，显著提高了发酵罐的利用率；单位罐产量（总亿）比月平均单罐产量提高了20．54％；在发酵过程尾气回收方而，每罐批比对照罐能回收利用9％～10％的排放尾气，减少了发酵污染物的排放。结论这种新型阻沫回收分离器可显著提高阿维菌素发酵过程中的放罐系数，还可能应用到其它发酵液性能相似的生物发酵产品。

等离子体作用结合氧限制模型选育辅酶Q_(10)高产菌株

将常温常压等离子体(Atmospheric and Room Temperature Plasma,ARTP)诱变和无水亚硫酸钠构建的氧限制筛选模型相结合,通过适合辅酶Q_(10)生产菌株的24孔板高通量快速培养技术,选育了类球红细菌Rhodobacter sphaeroides耐氧限的高性能突变株。实验结果表明:该菌株诱变筛选最合适的ARTP诱变时间为25 s,氧限制平板上无水亚硫酸钠的最佳质量浓度为0.4 g/L,24孔板上该菌氧传递的最优装液量为2.0 mL、发酵周期为48 h,在上述条件下,最终选育出了氧限制条件下辅酶Q10合成效率高的突变菌株R.sphaeroides F5D13。在5 L发酵罐分批培养过程中,该高产菌株表现出了较强的氧亲和力,单位菌体的合成效率比出发菌株提升了18%。

二硫键对毕赤酵母表达重组人复合α干扰素的降解与聚合影响

毕赤酵母(Pichia pastoris)表达重组人复合α干扰素(cIFN)时会形成cIFN分子内二硫键异构体,cIFN发生强烈的降解、聚合等不均一表达现象。体外试验证实了cIFN的3种二硫键异构体,研究了形成不同二硫键异构体的条件和各自的稳定性,包括降解与聚合。当cIFN分子内部二硫键破裂时会对其稳定性造成致命影响,从而使cIFN更容易遭到发酵液中蛋白酶降解和聚合。