猪肌内脂肪前体细胞成脂分化中miRNA差异分析

miRNA在成脂分化的过程中发挥着重要的调控作用,本研究旨在探究miRNA在猪肌内脂肪(Intramuscular Fat,IMF)前体细胞成脂分化过程中的表达模式,并对其潜在的调控功能进行分析。通过SmallRNA-seq、实时荧光定量PCR、miRanda、RNAhybird等技术和软件,对猪IMF前体细胞成脂诱导分化过程中miRNA的表达模式及靶基因进行了生物信息学分析。结果显示:猪IMF前体细胞诱导4 d后出现脂滴,在诱导0 d和4 d的猪IMF前体细胞中共鉴定到617个miRNAs,其中22个miRNAs诱导4 d表达显著上调,27个miRNAs表达下调;差异miRNAs共预测到13 869个靶基因,GO分析和KEGG分析发现靶基因主要富集到细胞分泌、细胞分解代谢、PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路等。此外,对miR-30家族的ssc-miR-30a-5p和ssc-miR-30c-3p进行定量验证,验证结果与测序结果一致。本研究揭示了miRNAs在猪IMF前体细胞成脂分化过程中的表达模式及潜在调控网络,为研究猪IMF沉积的调控机制奠定了前期基础。

猪RNA聚合酶Ⅱ单克隆抗体的制备与应用

旨在制备猪RNA聚合酶Ⅱ的单克隆抗体并进行初步应用。本研究采用生物信息方法预测免疫原,将其化学合成后免疫5只4~8周龄Bal b/c雌性小鼠,对免疫后呈现阳性的小鼠进行细胞融合试验,取其脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合并获得能稳定分泌抗RNA PolⅡ的杂交瘤细胞。鉴定结果显示,RNA PolⅡ单克隆抗体的重链为IgG 2A型,轻链为Kappa型。利用间接ELISA方法对杂交瘤细胞进行筛选和亚克隆,获得了8株稳定分泌RNA PolⅡ单克隆抗体的杂交瘤细胞株。将其初步应用到染色质免疫共沉淀(ChIP-seq)技术,并与商业化抗体的富集性进行比较,结果表明,本研究得到的单克隆抗体富集性更强。本研究获得的猪RNA PolⅡ单克隆抗体可为表观遗传学的研究提供理论基础,并且提供重要的生物学材料。

Dkk2基因对雌性小鼠卵泡发育过程的功能探究

卵巢颗粒细胞的生长对哺乳动物卵泡发育至关重要,本研究旨在探究Dkk2对雌性小鼠卵泡发育的影响,并对其潜在的调控机制进行分析。运用Crispr-cas9的方法构建Dkk2基因敲除C57BL/6小鼠,通过免疫荧光、免疫组化和蛋白免疫印迹等实验探究了Dkk2基因敲除对小鼠卵泡发育的影响及其作用机制。结果显示:相比野生型小鼠,Dkk2基因敲除小鼠的产仔数和原始卵泡显著减少,卵泡闭锁显著升高;抑制Dkk2的表达会显著促进小鼠卵巢颗粒细胞凋亡,抑制细胞增殖;对8周龄Dkk2基因敲除小鼠的卵巢组织进行转录组测序发现,Dkk2可能通过Wnt信号通路调控卵巢颗粒细胞的增殖和凋亡。本研究揭示了Dkk2在小鼠卵泡发育过程中的作用,可为哺乳动物繁殖性状的遗传改良提供新的靶基因。

LbCas12a蛋白的原核表达及活性检测

【目的】获得具有体外切割活性的来自毛螺旋菌属(Lachnospiraceae)ND2006的LbCas12a蛋白,以期为LbCas12a的应用研究提供重要的生物学工具。【方法】根据pMBP-LbCas12a质粒(Addgene,113431)的基因序列合成LbCas12a基因,并将其与pET-28a(+)线性化载体进行同源重组,构建重组质粒pET28a-LbCas12a,经测序和NheⅠ、SalⅠ双酶切鉴定后将阳性重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中进行IPTG诱导表达。通过12%SDS-PAGE凝胶电泳检测确定IPTG诱导的最佳浓度及温度,鉴定重组蛋白的表达形式,通过Ni-NTA树脂亲和层析的方法进行纯化、超滤法浓缩,BCA法检测蛋白浓度。将浓缩后的LbCas12a与猪细小病毒(PPV)靶标DNA、CRISPR RNA(crRNA)及偶联荧光基团的非特异性单链DNA(ssDNA)探针FQ共孵育,设置1个无LbCas12a蛋白的对照组、4个不同蛋白浓度(125、250、500、1000 nmol/L)的试验组,检测不同组别ssDNA探针的荧光强度,检测测试位点PPV活性。【结果】测序和NheⅠ、SalⅠ双酶切鉴定结果表明,重组质粒pET28a-LbCas12a构建成功且无移码突变。12%SDS-PAGE凝胶电泳检测结果表明,IPTG诱导表达的最佳浓度为0.5 mmol/L,最佳温度为37℃,表达形式主要为可溶性表达。蛋白浓度检测结果表明,浓缩后的蛋白浓度为485 ng/μL,质量为143 ku。活性检测结果表明,125、250、500、1000 nmol/L LbCas12a蛋白组的荧光强度均极显著高于对照组(P<0.01)。【结论】本研究成功表达出高活性的LbCas12a蛋白,且LbCas12a蛋白具有体外切割ssDNA的反式活性,为后续基于CRISPR-LbCas12a系统的分子检测技术奠定了基础。