猪源屎肠球菌生物学特性分析及电转化条件的优化

为了获得屎肠球菌基因工程菌株,试验首先用选择性培养基对猪新鲜粪便中的屎肠球菌进行分离鉴定,然后对屎肠球菌分离株进行毒力基因检测、药敏试验、耐受试验及抑菌效果检验,针对该分离株进行电转化条件(甘氨酸添加量、培养时间、洗涤缓冲液、质粒大小、质粒质量浓度、电压、复苏时间、电转杯规格)的优化,并采用PCR方法对转化菌株进行验证,最后分析培养基中的氯霉素和葡萄糖对转化菌株生长的影响。结果表明:从猪新鲜粪便中分离到1株屎肠球菌,该分离株不含有毒力基因Asa1、cylA、efaA、esp、gelE和hyl,对β-内酰胺类抗生素(氨苄西林、头孢噻吩、青霉素G)、四环素类抗生素(米诺环素)和氯霉素类抗生素(氯霉素)敏感,对氨基糖苷类抗生素(阿米卡星、卡那霉素、庆大霉素)、大环内酯类抗生素(红霉素)和四环素类抗生素(四环素)耐药;在25℃生理盐水中静置培养12.5 h的存活率没有显著变化(P>0.05),50℃以下水温下静置15 min存活率接近100%,对强酸和胆盐具有一定的耐受能力,对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌具有一定的抑制作用。将该分离株作为感受态细胞进行电转化,感受态细胞制备过程中培养基中甘氨酸添加量为2 g/mL、培养时间为16 h、用洗涤缓冲液Ⅴ(300 g PEG1000与700 mL超纯水的混合溶液)进行洗涤可获得较高的转化效率,电转化过程中质粒pAM4010k、质粒质量浓度为0.878 g/L、电压为1400 V、复苏时间为120 min、用1 mm电转杯可获得较高的转化效率。经PCR验证,该分离株可成功导入目的质粒。培养基中是否含有氯霉素对转化菌株生长没有明显影响,含葡萄糖对转化菌株的生长具有促进作用。说明本试验分离到的屎肠球菌是1株潜在的益生菌,具有开发为基因工程菌的潜力。

枯草芽孢杆菌复合微生态制剂对鸡坏死性肠炎回肠黏膜损伤的预防作用

鸡坏死性肠炎(necrotic enteritis, NE)主要是由产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens,CP)引起的雏鸡肠道的一种疾病。本试验旨在探讨微生态制剂对G型坏死性肠炎所致的回肠黏膜损伤的预防作用。将60只1日龄健康817雏鸡随机分成4组,分别为空白对照组(Control组),微生态制剂预防1组(MEA 1组),微生态制剂预防2组(MEA 2组),坏死性肠炎感染阳性对照组(NE组),14日龄时灌胃CP,连续攻菌后3 d剖检进行回肠的病理学检查。结果显示,MEA 1组、MEA 2组肉仔鸡回肠组织形态与Control组相比有所改善,绒毛长度/隐窝深度比、黏蛋白含量、抗氧化水平、sIgA水平均显著高于NE组(P<0.05)。同时应用qPCR检测了肠黏膜紧密连接蛋白claudin-1、ZO-1和ZO-2的mRNA表达量,发现MEA1组、MEA2组以及对照组比较差别不大,但均显著高于NE组(P<0.05),而添加微生态制剂组的ZO-2的表达量显著高于对照组和NE组(P<0.05)。结果证实,微生态制剂的添加可以在一定程度上缓解坏死性肠炎所致的回肠黏膜形态结构改变,减轻产气荚膜梭菌对回肠黏膜的刺激,提高机体抗氧化水平,缓解机体炎症反应。