南疆部分地区绵羊捻转血矛线虫苯并咪唑抗性相关分子Ⅰ型β-微管蛋白基因的多态性分析

为了解南疆地区绵羊捻转血矛线虫对苯并咪唑类药物的抗性相关分子β-微管蛋白基因的多态性,本研究对克州及喀什的183条捻转血矛线虫成虫进行ITS-2基因特异性PCR鉴定后,对抗药相关的Ⅰ型β-微管蛋白基因进行了扩增和测序,并对该抗药基因的单核苷酸多态性(SNP)167、198和200位点进行了分析。结果:在2个地区种群中,198位点及200位点均发生不同程度突变,且以198位点突变为主,暂未在167位点发生突变;两地共发现了5种基因型,其中198位点纯合敏感型及200位点纯合抗药型(喀什12条占12.37%,克州2条占2.33%),198位点纯合抗药型及200位点纯合敏感型(喀什23条占23.71%,克州7条占8.14%)两地均存在,提示这2个种群都存在抗药性。本研究首次报道了南疆部分地区捻转血矛线虫种群Ⅰ型β-微管蛋白基因存在苯并咪唑类药物抗药性突变,为新疆地区捻转血矛线虫病的有效防控及抗药性研究提供理论依据。

抗捻转血矛线虫天然H11蛋白单克隆抗体的制备及特性分析

为制备捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)天然H11蛋白的单克隆抗体,以伴刀豆球蛋白(Concanavalin A,Con A)凝集素提取的天然H11蛋白为免疫原,免疫4~6周龄雌性BALB/c小鼠,3次免疫后分离小鼠脾细胞并将其与SP2/0细胞进行融合,通过间接ELISA方法筛选,获得2株能稳定分泌抗H11蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为A1E3和A10E1。通过亚型鉴定和免疫学分析显示,2株单克隆抗体的重链均属于IgG1,轻链均为κ型,并且这2株单抗均能识别虫体天然抗原H11。免疫组化定位和体外幼虫发育抑制试验表明,mAb A1E3可以定位到成虫的肠道微绒毛部位,该抗体能够抑制四期幼虫的生长发育。单抗的成功制备不仅为研究H11蛋白保护性抗原表位以及开发表位疫苗奠定基础,也为单抗治疗动物捻转血矛线虫病提供了潜在的应用前景。

粪类圆线虫感染性Ⅲ期幼虫和寄生性雌虫miRNA的鉴定

目的鉴定粪类圆线虫感染性Ⅲ期幼虫(iL3)和寄生性雌虫(pF)的微小RNA(miRNA),分析差异表达miRNA及其靶基因的功能。方法从粪类圆线虫感染犬粪便中收集iL3。取4000~5000条iL3于颈后皮下注射感染健康犬,感染后21 d,从肠道中采集pF。提取iL3和pF的总RNA并测序。测序数据与粪类圆线虫基因组和鼠类圆线虫miRNA比对筛选保守的miRNA,用miRDeep2通过颈环结构分析、成熟序列比对筛选miRNA。分析iL3和pF的miRNA表达谱,筛选差异表达miRNA,预测差异表达miRNA的靶基因,对log2(差异倍数)>1和每百万转录本上的读数(TPM)>1000的未注释miRNA的靶基因功能进行分析。用ClusterProfiler对差异表达miRNA靶基因进行GO富集分析。选取11个未注释或保守的差异表达miRNA进行实时荧光定量PCR(qRT‑PCR)验证,以粪类圆线虫甘油醛‑3‑磷酸脱氢酶基因(GenBank登录号:BI773092.1)为参照基因,计算差异表达miRNA的相对转录水平。结果共鉴定出265个miRNA,包括130个保守的miRNA和135个未注释的miRNA。其中,134个miRNA在iL3和pF之间差异表达(包含77个保守的miRNA和57个未注释的miRNA),251个为iL3和pF所共有,10个为iL3特有,4个为pF特有。差异表达miRNA靶基因预测结果显示,57个未注释的miRNA中,有12个差异倍数>2且TPM>1000,有248个靶基因与秀丽隐杆线虫同源,其中35.08%(87/248)的靶基因与发育相关,其余与应激、运动和蜕皮等相关。大部分在pF高表达未注释的miRNA靶向SSTP_0000114700。差异表达miRNA靶基因的GO分析结果显示,共5595个靶基因被富集,其中富集靶基因数居前5位的分别为膜组成成分(1821个)、核酸结合(561个)、细胞核(450个)、蛋白质水解作用(365个)和信号传导(284个)。qRT‑PCR验证结果显示,sst‑miR‑86‑5p、sst‑84‑5p、sst‑novel‑104、sst‑miR‑92‑3p、sst‑miR‑34a‑3p、sst‑miR‑81a‑5p、sst‑miR‑1‑3p、sst‑novel‑108、sst‑miR‑124‑5p、sst‑miR‑50‑3p、sst‑novel‑51的log2(差异倍数)分别为-2.13、6.39、4.46、-3.69、-3.69、2.34、-2.48、-2.41、-2.30、2.25、-3.32,转录组分析获得的log2(差异倍数)分别为-3.05、4.98、4.07、-4.9、-3.66、0.98、-3.79、-2.61、-0.99、0.63、-1.55。qRT‑PCR与转录组分析获得的上调、下调趋势结果一致。结论获得粪类圆线虫感染性Ⅲ期幼虫和寄生性雌虫的miRNA表达谱和差异表达miRNA,差异表达miRNA与粪类圆线虫的生长发育和繁殖功能相关。