不同猪繁殖与呼吸综合征疫苗组合体液免疫效果评估

为了比较不同猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)疫苗不同免疫程序对体液免疫效果的影响,本试验选择新引进猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)抗原和抗体均为阴性后备母猪的3个猪场,将各场内猪只按体重分为3个阶段:7~20、20~35和35~50 kg,各场分别从中选取20头猪,共180头猪。每场选用1种免疫方案,第1组混合疫苗组,为首次免疫PRRS弱毒疫苗(CH-1R株),28 d后加强免疫PRRS灭活疫苗(CH-1a株);第2组弱毒疫苗组,为2次均免疫PRRS弱毒疫苗;第3组灭活疫苗组,为2次均免疫PRRS灭活疫苗。疫苗首次免疫后14、28、42和56 d采集猪血清,进行特异性PRRSV ELISA(N蛋白)检测和中和抗体评价;首次免疫后14和28 d采集猪血液,进行PRRSV实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测血液内是否存在PRRSV;统计试验猪分娩后头胎的活仔数、断奶仔猪数和窝均总仔数,进行临床数据比较分析。结果显示,35~50 kg体重阶段猪只接种疫苗后ELISA检测抗体水平增高较其他2个阶段更明显。混合疫苗组在免疫56 d时血清ELISA阳性率为100%,且ELISA结果极显著高于弱毒疫苗组和灭活疫苗组(P<0.01)。尽管各组没有产生特异性抗NADC30-like毒株的中和抗体,但针对PRRSV经典和高致病性毒株的中和抗体保护效价结果显示,混合疫苗组在免疫56 d时中和抗体效价极显著高于弱毒疫苗组和灭活疫苗组(P<0.01);RT-qPCR检测未发现阳性猪;各组试验猪分娩后头胎的活仔数、断奶仔猪数和窝均总仔数之间差异不显著(P>0.05)。结果表明,混合疫苗组对体液免疫的促进效果显著优于弱毒疫苗组和灭活疫苗组。该试验为临床正确选择PRRS疫苗免疫方案提供了科学数据。

2014年猪群常见细菌性疫病的分离鉴定与流行病学调查

2014年华中农业大学动物疫病诊断中心对湖北、湖南、河南、广东、浙江等21个省市送检的12 452份临床病料进行细菌分离、生化试验和PCR方法鉴定,共分离出3 926株致病菌,并对其中所分离到的225株副猪嗜血杆菌和231株链球菌采用玻片凝集方法进行血清型分型。结果表明链球菌、副猪嗜血杆菌、巴氏杆菌、波氏杆菌、致病性大肠杆菌和猪丹毒丝菌等9种病原菌已严重影响我国规模化养猪业的健康生产。

2014年规模化猪场临床主要疫病的血清学检测

华中农业大学动物疫病诊断中心2014年针对全国26个省市地区规模化猪场送检的38 375份血清样品进行了临床常见疫病的血清学分析,主要包括猪瘟(HC)、伪狂犬病(PR)、猪繁殖与呼吸综合征(PRRS,猪蓝耳病)、猪圆环病毒病(PCV2)、猪细小病毒病(PP)、乙型脑炎(JE)等。结果显示,送检血清样品猪瘟抗体检测阳性率为80.56%,其中育肥猪和保育猪送检样品的猪瘟抗体阳性率分别为72.23%和46.23%。伪狂犬病野毒鉴别诊断阳性检出率为27.34%,高于往年同期水平。猪繁殖与呼吸综合征抗体平均阳性率为80.76%。圆环病毒病抗体阳性率为79.55%。

2013年全国规模化猪场主要疫病血清学调查分析

运用ELISA方法对全国26个省市地区的34 260份血样进行了HC、PR、PRRS、PCV2、FMD、PP、JE等病毒性疾病的血清抗体检测评估,分析了不同区域不同时期各疾病抗体水平的差异,比较了近三年来国内各疾病抗体水平变化趋势,为规模化猪场当前主要疾病防控提供参考依据。

一例猪蓝耳病病毒、猪圆环病毒2型和猪链球菌血清2型混合感染的诊断及防控

2019年11月底湖北某商品猪场育肥猪只出现咳嗽、喘气、呼吸困难等症状,为了查找病因、控制疫情、减少损失,采用流行病学调查、临床检查、病理剖检和实验室检测方法进行综合诊断,并根据诊断结果及猪场具体问题提出了防控建议。结果表明:该猪场育肥猪感染了猪蓝耳病病毒NADC30-like毒株、猪圆环病毒2型,同时混合感染了血清2型猪链球菌,分离菌对头孢类药物(头孢曲松、头孢喹肟、头孢他啶)、大观霉素及氨苄西林高敏,通过实施综合防控措施后病情得到了有效控制。说明该猪场育肥猪只发病的主要原因为猪蓝耳病病毒NADC30-like毒株和猪圆环病毒2型及猪链球菌血清2型混合感染,应加强防控。

一例育肥猪猪呼吸道疾病综合征的诊断

猪呼吸道疾病综合征(porcine respiratory disease complex,PRDC)是由多种病原及环境条件等多种因素引起的猪呼吸系统疾病。2019年4月份,湖北省某猪场育肥阶段猪只出现明显的呼吸道症状,且发病率高达60%,死亡率约为8%,造成了严重的经济损失。为了对该病进行诊断,试验采用剖检病变、实验室检测进行诊断,对分离菌进行药敏试验,并根据诊断结果进行防控。结果表明:根据病猪临床症状、剖检病变及实验室检测结果,最后确定该场PRDC是由细菌、病毒混合感染所致。推断可能是猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)与猪圆环病毒2型(PCV-2)混合感染引起免疫抑制后继发多杀性巴氏杆菌(Pm)和副猪嗜血杆菌(Hps)、猪链球菌(SS)感染所致。可采取改善饲养环境、药物治疗及对猪群进行群体保健等防控措施。说明猪场应重视PRDC的实验室诊断及防控。

一例猪巴氏杆菌病的诊断与防控

猪巴氏杆菌病(Swine pasteurellosis)是由多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida, Pm)引起猪的一种散发性、热性传染病,常以败血症和炎性出血过程为主要特征。巴氏杆菌病的暴发和流行给养猪业造成了巨大的经济损失。研究对湖北某黑猪场一例巴氏杆菌病进行诊断,通过猪场实地调查、临床检查、病理剖检和实验室检测,最终确诊该场为A型多杀性巴氏杆菌感染所致发病。并通过药敏试验,筛选敏感药物,改善猪舍环境等一系列针对性措施,效果显著。该案例可为猪场巴氏杆菌病的诊断和防控提供参考。

猪圆环病毒3型的分离及致病性分析

猪圆环病毒3型(porcine circovirus type 3,PCV3)是2016年由美国首次报道引起母猪繁殖障碍的一种新型猪圆环病毒,该病毒的致病性尚不完全清楚。为研究PCV3对断奶仔猪的致病性,本研究用PK-15细胞自临床病料分离到1株PCV3毒株,命名为PCV3/CH/HB/XY/2018,全基因组测序分析表明,该毒株属于PCV3a-IM基因亚型。分别用PCV3阳性病料初始匀浆液和第8代细胞培养物采用滴鼻和肌肉注射2种方式感染28日龄断奶仔猪,每组试验猪5头,并设置空白对照组。通过观察和分析试验猪的临床表现、体温、增重、病毒血症、各组织的病毒载量和病理变化等方面评价仔猪感染试验结果。结果显示:PCV3阳性病料初始匀浆液和细胞培养物在感染断奶仔猪后均会引起仔猪出现体温上升、消瘦、皮炎和生长缓慢等现象;病毒血症时间超过14 d,但21 d消失,病毒的组织分布结果表明,PCV3主要感染扁桃体、淋巴结等免疫器官,在脾、肺和扁桃体等组织中的病毒载量最高;感染猪可出现间质性肺炎、淋巴小结增生和嗜酸性粒细胞增多等病理变化。本研究表明PCV3/CH/HB/XY/2018毒株对断奶仔猪有致病性,为PCV3的致病机制研究奠定了基础。

基于16S rDNA高通量测序技术分析受水灾影响猪场水样的菌群特征

2021年7月,河南省部分地区突发特大水灾,致使受灾区域内的猪场损失惨重,本研究旨在探究水灾发生后猪场水样中存在的病原菌,为猪场防控可能出现的疾病提供技术支撑。通过实地采样和委托采样的方式,获得了26个受灾猪场中的48份水样,包括19份猪饮用水、22份场内积雨水和7份废弃污水,采用菌落计数和高通量测序技术,对样品的细菌总数和菌群丰度进行分析研究,同时对采集的水样开展消毒剂杀菌试验。结果发现:饮用水、积雨水和污水中的平均含菌量分别为1.55×10^(5)、1.88×10^(8)和3.70×10^(9)CFU·mL^(-1),其中污水中的细菌总数最多,其次为积雨水,饮用水中的细菌总数最少,但远超国家饮用水的安全标准。本研究在不同种类的水样中均检测到了链球菌属、埃希氏杆菌属、弓形杆菌属、不动杆菌属和假单胞菌属等潜在的致病菌属,以及嗜低温弓形杆菌、猪链球菌、大肠杆菌、鲍曼不动杆菌和豚鼠气单胞菌等致病菌。杀菌试验显示,氯制剂终浓度达到2500mg·L^(-1),作用30 min即可杀灭积雨水和污水中所有的细菌。本研究发现,水灾后养猪场内的水样中含有多种致病菌,规模化猪场可选用含氯消毒剂对场内污染的水体进行消杀,以确保人和猪群的健康安全。

猪多杀性巴氏杆菌和链球菌混合感染的诊治及防控

为了确定湖北省某规模化猪场病死猪的发病原因,试验调查了猪场大体概况,解剖发病猪采集肺脏、气管等病料,并进行细菌分离、纯化,采用分子生物学方法进行核酸检测及血清型鉴定,利用药敏试验分析分离菌对常用抗菌药物的耐药性并提出防治方案。结果表明:从样品中未检测到病毒核酸,仅检测到细菌核酸,经测定该猪场病死猪混合感染了猪多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,Pm)和猪链球菌(Streptococcus suis,SS),其中Pm的荚膜多糖基因型为D型,SS为血清9型;分离株Pm-D和SS-9对氧氟沙星、强力霉素、恩诺沙星、头孢拉定较敏感。根据药敏试验结果并结合该猪场情况提出综合防控意见,采用后发病猪病情得到有效控制。说明毒力较强的细菌原发致病可造成较大危害,药敏试验对于细菌性疾病的快速治疗和预防起到了至关重要的作用。

猪胸膜肺炎放线杆菌ApxI毒素中和试验的建立与初步应用

为建立测定血清中猪胸膜肺炎放线杆菌(APP)外毒素ApxI中和抗体的方法,本研究采用(NH4)2SO4沉淀法从血清10型APP培养液中经盐析浓缩提取具有溶血活性的天然毒素ApxI,将毒素与待检血清在37℃孵育2 h,加入4%猪红细胞悬液并反应0.5 h,利用酶标仪测定反应混合物上清液的OD_(540nm)值判断溶血程度,计算出能够保护50%红细胞不发生溶血的最低血清稀释倍数,即为该血清的中和效价。利用该方法进一步检测了副猪嗜血杆菌和多杀性巴氏杆菌等阳性血清,无交叉反应,表明该方法特异性较强;利用该方法最高能够检测到中和效价为1:1580的APP ApxI毒素抗体阳性的猪血清,表明建立的中和试验具有较高的敏感性;以BALB/c小鼠为模型的感染试验结果表明,当其血清中ApxI毒素抗体的中和效价达到1:20时能够为小鼠提供有效保护。采用建立的方法检测临床采集的103份猪血清样品,能够有效检测其中和抗体,表明该方法可以应用于临床检测可分泌ApxI毒素的APP的感染和含ApxI毒素的亚单位疫苗免疫效果评估,为评价亚单位疫苗的免疫效果和猪传染性胸膜肺炎的诊断提供了技术支持。

当前新发伪狂犬病的分子流行特点及防控方案

猪伪狂犬病(PR)是由伪狂犬病毒(PRV)引起的一种急性传染病,主要以种猪繁殖障碍、新生仔猪急性死亡、断奶-育肥猪莫名发热和呼吸道症状为主要临床表现,已成为猪场重点防控的病毒性传染病。20世纪80年代,该病在我国大面积暴发流行,给国内养殖业带来严重损失。随着伪狂犬病疫苗的广泛应用,该病得到了很好的控制,在国内一直处于平息状态。但自2011年以来,猪伪狂犬病卷土重来,先后在全国不同地区暴发流行,引起了业界的广泛关注和深刻反思。"伪狂犬病毒是否发生变异或毒力增强"、"猪伪狂犬病防控方案是否出现漏洞"、"传统疫苗还能不能提供有效保护"等种种猜测一直在业内流传,笔者所在实验室近年来进行了大量的研究,并相继从临床分离到三十多株伪狂犬病新变异毒株,一些研究结果和数据分析或许为猪伪狂犬病疫情再发找到了佐证。针对猪伪狂犬病流行新形势和发病新特点,结合临床疫情处理和成功防控案例,及时调整免疫策略,探寻一种更为有效的伪狂犬病免疫方案,在当前变异伪狂犬病阳性感染场或受威胁场推广应用中显得尤为重要。

一例猪瘟混合感染副猪嗜血杆菌和猪蛔虫的案例诊治

2019年11月底,湖北某商品猪场保育猪只出现厌食、消瘦、呼吸困难、咳嗽等症状,偶有病猪急性死亡,为查找病因,控制疫情,减少损失,依次通过流行病学调查、病理剖检和实验室检测,最终确定该发病猪场为感染猪瘟病毒,进而继发感染Hps-4混合感染,并伴随蛔虫感染导致。通过筛选敏感药物治疗,优化生产管理,成功控制了此次疫情。该案例对此次疫情进行了分析总结,就加强生物安全建设,优化养殖管理,实现生产质量可控提供了参考建议。也为猪瘟混合感染呼吸系统细菌性疾病的防控提供参考。

一例高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒及大肠杆菌混合感染的病例分析

高致病性猪繁殖与呼吸综合征（HP-PRRS）是由变异株引起的一种急性高致死性疫病，可引起母猪呼吸道症状、流产、死胎，仔猪和育肥猪发生严重的败血性变化、呼吸道症状，并且死亡率高。近年来，常出现猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）普通株与变异株及猪瘟病毒（CSFV）、猪伪狂犬病毒（PRV）、猪圆环病毒2型（PCV-2）单独或多种病原混合感染等情况。PCV-2感染主要引起断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）、怀孕母猪繁殖障碍和猪皮炎肾炎综合征（PDNS），猪群感染率高，经济损失巨大。

一株马冠状病毒的分离鉴定及遗传演化分析

马冠状病毒病是由马冠状病毒(equine coronavirus,ECoV)引起的一种马新发胃肠道病毒病,成年马感染后主要出现发烧、腹痛和腹泻等症状。1975年,马冠状病毒感染首次在美国出现,此后在多个国家和地区均有流行,此前我国仅从山东腹泻驴的小肠样品中分离得到了一株重组马冠状病毒。【目的】了解ECoV中国毒株的基因组成、亲缘关系以及生物学特性,可以为我国ECoV流行现状和遗传演化趋势提供依据,为ECoV防控产品的研发提供材料。【方法】对湖北省武汉市黄陂区腹泻马匹的粪便样品进行RT-PCR检测,对检测阳性样品进行病毒分离,并利用靶向ECoV S1蛋白的单克隆抗体通过间接免疫荧光试验(indirect immunofluorescence assay,IFA)对分离的病毒进行验证。根据ECoV-JL株全基因组测序结果,对全基因组、N基因和NS2基因进行了基因组系统发育分析和同源性比较。【结果】成功分离到一株ECoV,并命名为ECoV-JL。透射电镜(transmission electron microscopy,TEM)观察分离到的病毒颗粒呈球状,且具有囊膜和冠状病毒典型的纤突结构。该分离株感染HRT-18细胞72 h后病毒滴度可到达峰值,半数组织培养感染剂量(tissue culture infectious dose 50%,TCID50)约为106.16TCID50/mL。ECoV-JL毒株可以在人回盲肠癌(human ileocecal cancer-18,HRT-18)细胞、人结直肠腺癌(human colorectal adenocarcinoma-2,Caco-2)细胞和人肝癌(human liver cancer cells,Huh7)细胞上稳定传代。ECoV-JL株与GenBank中现有的ECoV全基因组序列相似性为97.9%-99.0%,系统发育分析发现ECoV-JL株属于单独的演化分支,与其他毒株的亲缘关系较远,说明ECoV-JL株可能是重组变异而来,其中NS2基因突变较多,NS2基因编码的差异是造成ECoV-JL株与其他毒株同源性较差的主要原因。【结论】本研究从腹泻马的粪便样品中成功分离并鉴定了一株ECoV,将其命名为ECoV-JL株,对该毒株生物学特性和亲缘关系的研究反映了湖北地区流行毒株的特点,为我国ECoV流行现状和演化趋势提供重要依据。

ASFV、CSFV、PRRSV多重荧光PCR检测方法的建立与应用

非洲猪瘟病毒(ASFV)、经典猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是目前影响猪群和我国养殖业的重要的3种病原,且3种疾病临床表现相似,因此,建立一种可以快速检测、区分3种病原的方法十分必要。本研究依据ASFV、CSFV、PRRSV的基因保守片段设计特异性引物和探针,建立了多重荧光PCR检测方法。结果显示,所建立的多重荧光PCR可同时检测ASFV、CSFV、PRRSV 3种病原,特异性好、灵敏度高,对3种病原的检测下限分别达到13,16,26个拷贝;重复性良好,组内及组间重复试验的变异系数(CV)均在2%以内。将ASFV OIE标准、CSFV、PRRSV国家标准荧光qPCR作为金标准,同时对180份样品进行检测对比,结果显示,本研究方法对CSFV灵敏性和特异性分别为94.59%和100.00%,总符合率为98.89%;对PRRSV灵敏性为92.68%,特异性为98.56%,总符合率为97.22%;未检测到ASFV。使用所建立的方法对839份临床样品进行检测,结果显示,CSFV、PRRSV是当前猪群疾病的主要病原,且育肥阶段猪只CSFV、PRRSV核酸检出率均显著高于保育阶段猪只(P<0.01)。结果表明,本研究所建立的方法具有较高的灵敏性和特异性,可用于临床样品检测,猪场在防控非洲猪瘟的同时也须加强对CSF、PRRS的防控工作。