2003年度华中农业大学动物病毒室猪病的诊断情况总结

2003年是疾病多发的一年,主要是由于猪圆环病毒病、蓝耳病和副猪嗜血杆菌病等新病的爆发,而且下半年饲料的主要原料玉米霉变,给养殖户带来很大的损失.本文根据病毒室全年的检测情况,对发病的主要情况进行统计分析,供大家参考.

动物医学专业创新性人才培养途径的初步研究——以塔里木大学“悬疑讲堂”为例

以塔里木大学悬疑讲堂为例,介绍了"悬疑讲堂"的设立性质、讲座内容、组织方法和学习效果,探讨了动物医学专业创新性人才培养的途径。认为"悬疑讲堂"的自由开放的方式,活跃的氛围,培养学生创新性思维的环节以及将兽医史、哲学文化、专业内容融为一体的做法值得推广。

2020—2022年华中地区犬副流感病毒检测及其F、HN基因系统发育分析

为探究华中地区犬副流感病毒(CPIV)的流行及遗传进化情况,利用RT-PCR方法对华中地区2020年9月—2022年1月收集的418份病料样品进行了CPIV检测,并利用生物信息学软件对分离的CPIV毒株的F、HN基因进行同源性、氨基酸位点分析及系统发育分析。结果显示:CPIV阳性率为15.8%,扩增获得9株CPIV的F、HN基因的序列,并成功分离培养9株CPIV毒株;同时,将分离株的F、HN基因与19株副流感病毒参考毒株进行序列比对分析,结果表明,F基因核苷酸同源性为95.1%~100%,氨基酸同源性为94.6%~99.8%,HN基因核苷酸同源性为95.9%~99.9%,氨基酸同源性为95.8%~99.6%;CPIV的F及HN基因与参考毒株相比均有部分氨基酸发生了突变;系统发育分析结果显示,本研究获得的8株分离株与美国株CPI-和CPI+处于同一分支上,亲缘关系较近,另一株分离株CS-324与中国株He N0718和韩国株D277位于同一分支上。本研究丰富了华中地区CPIV的流行病学调查资料,并为该病的综合防控提供了理论依据。

2023年度肉牛牦牛产业与技术发展报告

本文基于对2023年肉牛牦牛产业特点及存在问题的分析,展望了2024年肉牛牦牛产业发展趋势,并提出了肉牛牦牛产业发展的相关建议。

不同猪繁殖与呼吸综合征疫苗组合体液免疫效果评估

为了比较不同猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)疫苗不同免疫程序对体液免疫效果的影响,本试验选择新引进猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)抗原和抗体均为阴性后备母猪的3个猪场,将各场内猪只按体重分为3个阶段:7~20、20~35和35~50 kg,各场分别从中选取20头猪,共180头猪。每场选用1种免疫方案,第1组混合疫苗组,为首次免疫PRRS弱毒疫苗(CH-1R株),28 d后加强免疫PRRS灭活疫苗(CH-1a株);第2组弱毒疫苗组,为2次均免疫PRRS弱毒疫苗;第3组灭活疫苗组,为2次均免疫PRRS灭活疫苗。疫苗首次免疫后14、28、42和56 d采集猪血清,进行特异性PRRSV ELISA(N蛋白)检测和中和抗体评价;首次免疫后14和28 d采集猪血液,进行PRRSV实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测血液内是否存在PRRSV;统计试验猪分娩后头胎的活仔数、断奶仔猪数和窝均总仔数,进行临床数据比较分析。结果显示,35~50 kg体重阶段猪只接种疫苗后ELISA检测抗体水平增高较其他2个阶段更明显。混合疫苗组在免疫56 d时血清ELISA阳性率为100%,且ELISA结果极显著高于弱毒疫苗组和灭活疫苗组(P<0.01)。尽管各组没有产生特异性抗NADC30-like毒株的中和抗体,但针对PRRSV经典和高致病性毒株的中和抗体保护效价结果显示,混合疫苗组在免疫56 d时中和抗体效价极显著高于弱毒疫苗组和灭活疫苗组(P<0.01);RT-qPCR检测未发现阳性猪;各组试验猪分娩后头胎的活仔数、断奶仔猪数和窝均总仔数之间差异不显著(P>0.05)。结果表明,混合疫苗组对体液免疫的促进效果显著优于弱毒疫苗组和灭活疫苗组。该试验为临床正确选择PRRS疫苗免疫方案提供了科学数据。

1株致仔猪脑膜炎的猪链球菌的分离鉴定及致病性分析

【目的】确定广东某猪场送检的疑似猪链球菌引起仔猪脑膜炎的病猪组织中的病原,并测定其药物敏感性和致病性,为猪场用药及探索该病原引起脑膜炎的机制奠定基础。【方法】对疑似猪链球菌引起的仔猪脑膜炎送检病料进行细菌分离培养、形态观察、生化试验及分子学鉴定,并对其开展药物敏感性试验、毒力基因测定、小鼠感染试验及病理组织学诊断。【结果】仔猪脑组织分离株在血平板上出现溶血现象,革兰染色镜检细菌被染成紫色,形态为圆形,部分呈链状排列。生化鉴定结果显示,分离株能发酵棉子糖、乳糖、菊糖、七叶苷,不能发酵山梨醇、甘露醇、阿拉伯糖、松三糖、D-核糖,马尿酸盐还原试验为阴性,与猪链球菌相符。测序分析后确定分离株为猪链球菌。血清型鉴定结果显示,分离株为9型猪链球菌,命名为GDS209。药物敏感性试验结果显示,分离株GDS209对头孢噻吩(先锋Ⅰ)、头孢氨苄(先锋Ⅳ)和氨苄西林/舒巴坦等10种抗菌药耐药,对替卡西林/克拉维酸、氟苯尼考、阿莫西林3种抗菌药敏感。毒力基因检测结果显示,分离株GDS209携带gdh、gapdh、fbps、orf 2、srtA、ccpA毒力基因,不携带mrp、sly、luxS、epf毒力基因。小鼠感染试验结果显示,分离株GDS209对小鼠的半数致死量(LD 50)为1×10^(9)CFU。组织病理学观察显示,分离株GDS209能引起昆明小鼠心脏、肝脏、脾脏、肺脏、脑不同程度的淤血和炎症。【结论】本研究分离到1株9型猪链球菌,该分离菌对大部分猪场常用抗菌药耐药,对替卡西林/克拉维酸、氟苯尼考、阿莫西林3种抗菌药敏感,本研究结果可为9型猪链球菌的临床诊断和药物治疗提供一定的参考依据。

武汉地区犬乳腺肿瘤的临床病理特征与良恶性的相关性分析

本研究旨在统计、调查武汉地区犬乳腺肿瘤的临床病理特征(年龄、性别、品种、绝育情况、坏死灶数、出血灶数)并分析其与肿瘤良恶性的相关性。临床收集犬乳腺肿瘤208例并统计品种、性别、年龄、绝育情况等临床信息,运用病理学方法进行组织学诊断后统计坏死灶和出血灶数,用SPSS27.0进行相关性分析。结果显示,武汉地区208例乳腺肿瘤患犬均为雌性,发病年龄1~15岁,平均发病年龄9.7岁,易发品种为贵宾犬和杂交犬,未绝育的犬更易发病。病理组织学诊断结果显示,乳腺肿瘤良恶比接近1∶1,其中,良性肿瘤高发类型为混合瘤和复杂瘤,恶性肿瘤高发类型为导管癌和混合癌,出血、坏死在恶性肿瘤中更加常见。经相关性分析可知患犬年龄与恶性肿瘤类型(P=0.016)、出血灶数(P<0.01)、坏死灶数(P<0.01)相关,出血灶数与坏死灶数(P<0.01)相关。年龄、坏死灶数和多灶性出血可作为犬乳腺肿瘤良恶性的独立影响因素。年龄大的犬发生乳腺肿瘤时易出现坏死和出血,年龄、坏死灶数、多灶性出血可作为诊断恶性肿瘤的临床病理特征,为临床诊断提供了一定的参考。

枯草芽孢杆菌复合微生物制剂对鸡坏死性肠炎的预防效果

为了研发有效预防鸡坏死性肠炎(necrotic enteritis,NE)的微生态制剂,选用1日龄817雏鸡120只,随机分为4个处理组,其中,空白对照(Control)组和坏死性肠炎(NE)组(用G型产气荚膜梭菌感染肉仔鸡建立NE模型)饲喂基础日粮、预防1(Prob1)组在基础日粮中添加0.2%的微生物制剂1、预防2(Prob2)组在基础日粮中添加0.2%的微生物制剂2;试验第14~16天Prob1组、Prob2组和NE组肉鸡连续灌胃产气荚膜梭菌(Clos-tridium perfringens,CP),探究在饲料中添加不同的枯草芽孢杆菌复合微生物制剂对该病的预防作用。结果显示:NE组肉鸡体质量低于Control组,试验第17、23天Prob1组、Prob2组体质量显著高于NE组(P<0.05)。NE组肉鸡空肠上皮细胞坏死脱落、绒毛变短、隐窝加深、绒隐比降低,使用枯草芽孢杆菌复合微生物制剂后肉鸡空肠绒毛结构较完整、绒毛长度和绒隐比显著高于NE组。NE组肉鸡空肠黏膜T-SOD、T-AOC、AKP活性低于Control组;试验第17天Prob1组、Prob2组肉鸡空肠黏膜T-AOC、AKP活性显著高于NE组,Prob1组肉鸡空肠黏膜T-SOD活性显著高于NE组;试验第23天,Prob1组、Prob2组肉鸡空肠黏膜T-SOD、T-AOC、AKP活性高于NE组,无显著差异;NE组肉鸡空肠黏膜MDA含量高于Control组,试验第17、23天Prob1组、Prob2组肉鸡空肠黏膜MDA含量低于NE组。NE组肉鸡的肠道紧密连接蛋白CLDN1、ZO-2基因表达量低于Control组,在试验第17天有显著差异;试验第17、23天,Prob1组、Prob2组肉鸡肠道紧密连接蛋白CLDN1、ZO-2基因表达量高于NE组,试验第23天Prob1组、Prob2组ZO-1基因表达量显著高于NE组。研究表明,日粮中添加枯草芽孢杆菌复合微生物制剂可以改善坏死性肠炎鸡的生长发育、提高肉鸡抗氧化能力以及肠道紧密连接蛋白基因表达量,且枯草芽孢杆菌复合微生物制剂1对鸡坏死性肠炎有较好的预防作用。

戊型肝炎病毒研究进展

戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus, HEV)是一种单链、非包膜的RNA病毒,目前可分为8个基因型。作为一种人兽共患病原体,HEV能引起人的急性病毒性肝炎和动物的感染,其主要的传播途径为粪-口传播,也可通过输血和母婴传播。HEV主要在发展中国家流行,而欧美等发达国家也有散发的病例。目前,检测HEV的常用方法是实时荧光定量RT-PCR和酶联免疫吸附试验(ELISA),也有学者利用反转录重组酶聚合酶扩增(RT-RPA)和CRISPR系统等新型检测方法进行HEV检测。在药物治疗方面,可用利巴韦林、干扰素或多烯磷脂酰胆碱(PPC)等化合物治疗HEV引起的感染,也可使用中药单味或复方改善临床症状并作协同治疗。接种疫苗被认为是预防和控制HEV感染的有效手段,但目前仍无有效的HEV体外细胞培养系统,传统的灭活苗和减毒苗无法批量制备。当前HEV疫苗的研究方向主要有基因重组蛋白疫苗、DNA疫苗、联合疫苗和口服疫苗等。接种疫苗是预防戊型肝炎的重要措施,采用切断传播途径为主的综合性预防措施也可控制该病的流行。笔者主要通过对HEV的检测方法、药物治疗和疫苗免疫等方面的研究进展进行归纳和总结,并对HEV的防控研究进行展望,以期为HEV的预防与控制提供新的思路。

新形势下我国人兽共患病防控挑战与应对策略

近20年来,多种新发人兽共患病疫情先后波及全球,严重危害人类健康、经济社会发展和农业安全,开展人兽共患病防控是持续性的重要任务。本文梳理了新发人兽共患病不断涌现、原有人兽共患病疫情反弹、全球一体化加快人兽共患病传播、世界新格局影响人兽共患病防控等全球防控态势,总结了我国在新型冠状病毒感染等新发突发人兽共患病有效防控、血吸虫病等主要常在常发人兽共患病有效控制或消灭、人兽共患病防控科技创新发展和政策法规支撑等方面取得的重大成效;凝练了我国在人兽共患病防控领域面临的新病频发、老病常发、外来病传入风险加剧且耐药性问题严重,防控技术创新能力不强、产品创制不足,源头防控力量薄弱、基层防控机制不够健全,国际交流与合作渠道受限等问题。论证形成了我国人兽共患病防控科技创新体系,覆盖病原学与流行病学、病原结构与功能、病原致病与免疫机制、诊断试剂、新型疫苗、新药创制、抗病育种、疫病综合防控与净化等主要研究方向,以增强我国人兽共患病源头防控的科技实力。进一步提出了我国人兽共患病防控策略,建议实施狂犬病、布鲁氏菌病、牛结核病、棘球蚴病等重大人兽共患病在动物群体中的净化和消灭计划,逐步净化消灭一部分老病;密切监测疫病流行动态、加强防控技术储备、高效应对突发传入病例,严防新发和突发人兽共患病。

牛支原体体外肺精准切片感染模型的建立

本研究旨在建立一种牛支原体体外感染模型-牛肺组织精准切片(precision-cut lung tissue slices,PCLS)感染模型。采集2月龄犊牛新鲜肺脏,经低熔点琼脂糖灌注、固定后,使用振动切片机制成厚度为250μm的牛PCLS,利用牛支原体野毒株HB0801(P1)及其传代致弱株P150以108 CFU·孔^(-1)的剂量进行体外感染,分别经qRT-PCR、乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性试验、3D荧光显微镜全景扫描、免疫组化等技术评估牛支原体在PCLS中的感染效果。结果显示正常PCLS在体外培养72 h后,细胞活力可维持在60%以上,组织形态学观察PCLS边缘清晰,肺泡结构正常;qRT-PCR检测牛支原体强、弱菌株在PCLS中的基因拷贝数,发现二者均可存活和增殖,免疫组化观察牛支原体主要定位于PCLS的肺泡腔周围以及支气管间隙,LDH试验检测发现牛支原体强、弱菌株感染18 h出现细胞毒性反应,二者均可诱导PCLS产生促炎因子IL-1β和IL-8,且强毒株诱导水平显著高于弱毒株(P<0.05)。本研究初步建立了牛支原体PCLS体外感染模型,提供了一种可模拟牛支原体体内感染试验的离体模型,为今后研究牛支原体与宿主相互作用提供借鉴和参考。

猪链球菌MnmE蛋白功能的初步研究

为了解析猪链球菌中MnmE蛋白的生物学功能,通过同源重组技术获得了mnmE基因缺失菌株,采用活菌计数、高效液相色谱、质谱分析、荧光定量PCR等技术,鉴定MnmE蛋白在猪链球菌中的主要功能。结果显示,与野生菌株(SC19)相比,mnmE基因缺失菌株(△mnmE)在酸性条件pH 4.5下的存活能力显著下降;氨基酸靶向代谢组学共检测到23种氨基酸及其衍生物,其中△mnmE缺失菌株中有17种氨基酸具有显著差异(P<0.05,倍数差异>1.2),尤其是精氨酸上调4.8倍,丝氨酸上调2.9倍。荧光定量PCR发现△mnmE缺失菌株中与环境适应性相关的精氨酸分解代谢基因ArcA下调表达显著,丝氨酸合成酶SerB上调表达显著。初步鉴定了MnmE蛋白与猪链球菌对酸性环境适应性相关,MnmE蛋白缺失后,精氨酸分解代谢基因下调表达导致精氨酸在菌体里积累,不能被分解成CO_(2)、ATP、NH_(3),使得细菌代谢紊乱、适应性减弱。

焦棓酸对猪链球菌体外抑菌效果试验

研究焦棓酸对猪链球菌的体外抗菌活性及对生物被膜的抑制作用,并初步探讨其抑菌机制。采用96孔微量稀释法测定常用抗菌药物及焦棓酸对猪链球菌的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度;平板活菌计数法和分光光度计测定焦棓酸对猪链球菌作用的时间-杀菌曲线;采用结晶紫染色法检测焦棓酸对猪链球菌生物被膜形成的影响;通过荧光定量PCR从转录水平分析焦棓酸对猪链球菌生长与生物被膜形成相关基因表达的情况。结果显示,猪链球菌2型HB菌株对磺胺异恶唑、磺胺甲恶唑耐药严重,焦棓酸对猪链球菌2型HB菌株的最小抑菌浓度为32μg/mL,最小杀菌浓度为64μg/mL,并且焦棓酸对猪链球菌的抑制作用呈剂量依赖性;焦棓酸在16μg/mL能显著抑制猪链球菌2型HB菌株生物被膜形成的能力;另外,经焦棓酸处理后,发现猪链球菌的生长、生物被膜形成、毒力相关基因ftsZ、stK、mrp、fbps、gapdh、ccpA、luxS下调表达。综上所述,焦棓酸可为耐药猪链球菌在临床上感染的治疗提供新思路。

利用大蜡螟幼虫和小鼠感染模型筛选猪链球菌血清2、3和9型三价灭活疫苗候选菌株

旨在评估临床分离的猪链球菌血清2、3、9型强毒株制备的三价灭活疫苗对小鼠的免疫保护效果。使用大蜡螟幼虫感染模型和小鼠感染模型,从临床分离的猪链球菌中筛选出血清2、3和9型强毒株各1株(SS1803、SS1803024、SS1696),检测其生长曲线和毒力因子。将菌株分别灭活及混合灭活后与佐剂混合,用4×10^(7)CFU、8×10^(7)CFU SS1803、2×10^(8)CFU、5×10^(8)CFU SS1803024、1×10^(8)CFU、5×10^(8)CFU SS1696及三价灭活苗(2×10^(7)CFU SS1803^(+)1.5×10^(8)CFU SS1803024^(+)3×10^(7)CFU SS1696)分别对BALB/c小鼠进行两轮免疫,采集血清检测特异性抗体水平,分别用3种菌株致死剂量攻毒后观察小鼠免疫保护率,同时用亚致死剂量攻毒三价苗免疫组,测定小鼠血、脑、肺、脾的组织载菌量和细胞因子IL-6、IL-12水平,并观察脑、肺、脾、肾中的组织病理变化。结果显示:3株疫苗候选菌株的毒力基因鉴定分别为SS1803:gapdh^(+)/sly^(+)/fbps^(+)/orf2^(+)/mrp^(-)/89K^(-)/gdh^(+)/epf^(+),SS1803024:gapdh^(+)/sly^(+)/fbps^(+)/orf2^(+)/mrp^(-)/89K^(-)/gdh^(+)/epf^(-),SS1696:gapdh^(+)/sly-/fbps^(+)/orf2^(+)/mrp^(-)/89K^(-)/gdh^(+)/epf^(-)。单价和三价疫苗免疫组均能产生对应免疫血清型的IgG抗体,以产生IgG1型抗体为主。三价疫苗免疫组能对2、3、9型3个菌株攻毒分别提供83.3%、66.7%和66.7%的保护率,能显著降低感染后小鼠组织中的载菌量,降低血清炎性因子水平和组织病变程度。本研究筛选临床流行率高的2、3、9型强毒株,联合制备三价灭活疫苗,能够对小鼠提供良好的免疫保护力,为猪链球菌多价疫苗的研发提供新的材料。

猪弓形虫病阻断ELISA方法的建立及初步应用

本研究利用制备的GRA7单克隆抗体为基础建立猪弓形虫病的阻断ELISA方法。以rGRA7重组蛋白免疫小鼠,取脾细胞进行细胞融合,筛选出4株能够稳定产生单克隆抗体的阳性单克隆细胞株。经对此单克隆抗体进行IFA和Western blot检测确认成功制备GRA7蛋白的单克隆抗体后,以重组蛋白为包被抗原对阻断ELISA方法进行优化后,经过重复性、交叉性、符合性实验验证本方法具有可重复性,与MAT符合性高。初步应用于288份临床样品检测,检出率为11.46%,与MAT检测结果重合率为84.8%。本研究成功制备弓形虫GRA7蛋白的单克隆抗体,并建立了一种猪弓形虫病的阻断ELISA方法,为弓形虫病的检测提出了新的方案。

OXSR1活性对p53依赖和非依赖途径介导的犬肾细胞凋亡的影响

【目的】研究氧化应激反应激酶1(oxidative stress-responsive 1,OXSR1)在犬肾细胞(Madin-Darby canine kidney cell,MDCK)凋亡中的作用,为深入理解MDCK凋亡通路及研究以OXSR1基因为靶向的MDCK凋亡的干预疗法提供参考。【方法】利用CRISPR/Cas9技术在MDCK-Cas9细胞上构建OXSR1基因敲除细胞系,在OXSR1基因敲除细胞中转入OXSR1基因回补与失活质粒以构建OXSR1基因回补与失活细胞系。以刺激剂MMC、JNJ-26854165、Rotenone分别刺激野生型细胞与OXSR1基因敲除、回补、失活细胞,通过流式细胞术检测激活的p53依赖和非依赖途径、ROS信号通路介导的细胞凋亡,并通过实时荧光定量PCR检测相关凋亡基因的表达情况。【结果】靶序列出现明显的Indel特征,证实OXSR1基因敲除细胞系构建成功。Western blotting检测显示,OXSR1基因回补与失活细胞系构建成功。流式细胞术发现,刺激剂MMC、JNJ-26854165、Rotenone均能诱导细胞发生不同程度的凋亡,其中在MMC和Rotenone刺激下,OXSR1基因敲除细胞凋亡率极显著或显著低于野生型细胞和OXSR1基因回补细胞(P<0.01;P<0.05),与OXSR1基因失活细胞无显著差别(P>0.05);在JNJ-26854165刺激下,OXSR1基因敲除细胞凋亡率极显著或显著低于野生型细胞、OXSR1基因回补和失活细胞(P<0.01;P<0.05)。实时荧光定量PCR检测发现,当MMC和Rotenone刺激细胞时,OXSR1基因敲除细胞的BCL-XL基因表达量极显著或显著高于野生型细胞和OXSR1基因回补细胞(P<0.01;P<0.05),与OXSR1基因失活细胞无明显差别(P>0.05);当JNJ-26854165刺激细胞时,OXSR1基因敲除细胞的BCL-XL基因表达量极显著高于野生型细胞、OXSR1基因回补与失活细胞(P<0.01),NOXA基因表达量极显著低于野生型细胞、OXSR1基因回补与失活细胞(P<0.01)。【结论】OXSR1基因及其激酶活性可调节MMC、JNJ-26854165、Rotenone刺激MDCK时BCL-XL基因转录,影响p53依赖和非依赖途径以及ROS途径介导的细胞凋亡。

金黄色葡萄球菌对苯扎溴铵敏感性与生物被膜形成能力相关性分析

以35株生猪屠宰场及养殖场来源的金黄色葡萄球菌分离菌株为试验材料,分析金黄色葡萄球菌对苯扎溴铵敏感性与生物被膜形成能力的相关性。采用微量肉汤稀释法检测金黄色葡萄球菌对苯扎溴铵的敏感性,结晶紫染色法检测生物被膜形成能力,基于全基因组测序结果分析屠宰环节的26株金黄色葡萄球菌多位点序列分型(multi-locus sequence typing,MLST)情况,以及消毒剂抗性与生物被膜形成相关基因的携带情况。结果表明,35株菌中,苯扎溴铵的最小杀菌浓度(minimum bactericidal concentration,MBC)范围为1~16 mg·L^(-1),强成膜能力菌株共16株,占总数的45.71%(16/35),其中93.75%(15/16)来自于屠宰链的下游。ST7是强成膜能力菌株的优势序列型(93.75%,15/16)。金黄色葡萄球菌生物被膜形成能力和苯扎溴铵MBC值呈正相关(相关系数为0.690),而消毒剂抗性与相关基因携带情况无关。综上,金黄色葡萄球菌可通过形成生物被膜提高对消毒剂的耐受性,减弱了苯扎溴铵的消毒效果,增加了养殖和屠宰环节中细菌污染和传播的风险。

基于猪流行性腹泻病毒GⅡb亚型重组荧光病毒中和抗体检测方法的建立

2010年以来,猪流行性腹泻病毒(PEDV)GⅡ型变异毒株的出现,导致全世界范围内猪流行性腹泻(PED)的病死率显著增加。疫苗免疫是PED有效防控的重要策略之一,疫苗诱导的中和抗体水平是免疫效果评价和疫苗质量评估的重要指标。然而,在Vero-CCL81上开展的PEDV经典中和试验中所添加的胰酶会导致试验结果不稳定等问题。本研究拟在构建稳定表达绿色荧光蛋白的重组病毒基础上,建立一种能准确评估样品中和抗体的检测方法。本研究在pUC57载体上克隆插入GⅡb亚型PEDV-GDU株部分ORF1a和ORF1b基因片段与其他结构基因片段,并通过无缝克隆技术将ORF3基因替换为EGFP基因,构建辅助质粒pUC57-PEDV-GDU-dORF3-EGFP,通过RNA定向重组技术拯救重组荧光病毒rPEDV-GDU-dORF3-EGFP。进一步通过间接免疫荧光试验(IFA)、Western blot和病毒生长曲线测定等方法,比较重组荧光病毒和亲本病毒生物学特性。最终利用重组荧光工具病毒筛选在不添加胰酶的条件下仍能支持PEDV有效增殖的细胞系,并建立中和试验方法。结果表明,成功拯救重组荧光病毒rPEDV-GDU-dORF3-EGFP,且在Vero-CCL81细胞上,重组荧光病毒与亲本病毒呈现相似的生物学特性。利用该重组荧光病毒筛选到一株亚克隆Huh7.10细胞可支持PEDV在无外源胰酶添加条件下的有效感染与复制。并利用Huh7.10细胞和重组荧光病毒成功建立了PEDV中和试验方法,相关性试验分析表明,该方法测定结果与ELISA抗体检测结果相关性高于PEDV经典中和试验。以上试验结果表明,本研究成功建立了PEDV-GDU毒株的反向遗传操作平台,为PED新型疫苗候选毒株的快速制备提供了有力的工具。此外,基于重组荧光病毒在Huh7.10细胞上建立的中和试验方法能更准确地测定血清中和抗体水平,为疫苗免疫效果的评估提供了有效的技术支持手段。

鱼腥草中产槲皮素内生真菌的分离鉴定

【目的】探索鱼腥草(Houttuynia cordata Thunb.)中是否存在产槲皮素的内生真菌。【方法】采用组织块法对鱼腥草内生真菌进行分离培养,分离纯化后收集菌丝利用薄层色谱(TLC)和高效液相色谱(HPLC)检测其代谢产物中的槲皮素,并分析其产量。采用形态学和内部转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)序列分析鉴定产槲皮素的内生真菌。【结果】从鱼腥草不同部位共分离得到9株内生真菌,其中由根中分离得到的菌株YXC-G1具有产生槲皮素的能力,为笋顶孢属(Acrostalagmus sp.)真菌,菌丝中槲皮素的含量为8.296 mg/g。【结论】从鱼腥草根部分离到1株产槲皮素的内生真菌YXC-G1,其可作为生产槲皮素的备选菌株。

宠物用大环内酯类抗寄生虫药物研究进展

大环内酯类抗寄生虫药物(ML)是一类传统的抗寄生虫药,在宠物驱虫上有广泛应用,对心丝虫和钩虫等体内寄生虫具有良好的杀灭效果。近年来,含该类药物的单方和复方药物制剂不断更新,已在宠物抗寄生虫药物市场中占有重要地位。因此,全面了解该类药物的各种信息对兽药研发人员和宠物临床兽医师至关重要。本文系统综述了ML的分类、作用机理和药物代谢动力学特征,并对不同药物的药效、毒性、中毒治疗以及靶寄生虫耐药性的产生进行了归纳总结,旨在为宠物寄生虫病临床用药和药物研发提供参考。